2021 Fiscal Year Annual Research Report
再生分化による網膜の機能再現と網膜変性疾患の新規治療
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20H03845
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| Research Institution | National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities |
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Principal Investigator |
世古 裕子 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所), 研究所 感覚機能系障害研究部, 研究部長 (60301157)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東 範行 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 非常勤講師 (10159395)
金田 誠 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (30214480)
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
梅澤 明弘 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 研究所, 研究所長/再生医療センター長/バイオバンク長 (70213486)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 網膜 / ダイレクト・リプログラミング / 視細胞様細胞 / 網膜双極細胞 / ミューラー細胞 / 神経節細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
網膜は一度損傷を受けると回復しない。本研究は、視覚障害の原因となる網膜変性疾患の病態解明や創薬に応用するため、低コスト・簡便で汎用性が高い細胞培養システムを確立するための基盤的研究である。これまでに、視細胞の発生に関わる４つの転写因子を用いたダイレクト・リプログラミングで、ヒト体細胞から約１週間で光刺激に応答する視細胞様細胞を分化誘導できること、この方法で作製した網膜色素変性患者細胞由来の変性視細胞モデルが病態解析の一助になる可能性を示した。令和３年度には、令和２年度にスモールスケール化（24-well plateの使用）されたアッセイ系を用い、ヒト皮膚線維芽細胞由来変性視細胞モデルの半定量評価を行った。光トランスダクション関連遺伝子および網羅的遺伝子発現解析から抽出されたF2RやCRYGDが、変性視細胞モデルにおいて発現低下していること、ERストレス阻害剤（4-PBA）によって発現がノーマライズされることを明らかにし、Nが少ないながら（N=2）、薬剤スクリーニングへの応用の可能性が示された（Rai et al, Seko, Stem Cell Res Ther,2022）。また、当研究室で構築した２種類のポリシストロニックレトロウィルスベクターを用い、網膜細胞への分化レベルを調べた。分担者の冨田は、ラットミューラー細胞株にポリシストロニックレンチウイルスベクターを用いて上記４つの転写因子を導入したところ、S-antigen遺伝子を発現する視細胞様細胞へと分化した。分担者の金田は、電気生理学的手法を用い、網膜コリン作動性アマクリン細胞におけるアセチルコリンの合成に必要なコリンの新奇な取り込み経路を発見し、この経路を介して取り込まれたコリンからアセチルコリンが合成されることを証明した（Maruyama et al, Kaneda, FEBS Open Bio, 2022）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和３年度は、目標はおおむね達成したが、ミューラー細胞からの誘導実験では、やや進捗が遅れている。視細胞様細胞への分化が確認されたが、ロドプシンを始めとする多くの視細胞特異的マーカーが検出されておらず、更なる条件検討が必要と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
“ダイレクト・リプログラミング”による網膜視細胞作製の応用範囲を広げることを目指し、ダイレクト・リプログラミングと網膜前駆細胞を経由するインダイレクト・リプログラミングを軸として、すでに成功している“視細胞様細胞”の作製における課題を克服し“最終分化した網膜視細胞（杆体と錐体）”と“網膜前駆細胞”を低コスト・簡便・高効率で作製することを目指す。さらに網膜双極細胞を新規に作製して網膜視細胞―双極細胞間シナプスを再構成し、網膜色素上皮細胞も合わせ、層別再生による網膜組織再構成を行い、病態解析、薬剤のスクリーニング、細胞移植に幅広く応用できるツールを開発し、これまで取り組んできたダイレクト・リプログラミングの技術の医療への応用につなげる基盤研究として知見を蓄積する。
令和４年度には、①誘導レベルの不完全性と不均一性の改善 ①-1 網膜前駆細胞の作製を継続。遺伝子発現プロファイリングを行い、その結果を培養条件の条件検討にフィードバックしながら、各種網膜細胞への分化誘導を目指す（世古、他）。①-2 視細胞分化を可視化するために樹立した、視細胞特異的プロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現するミューラー細胞株を用い、高効率で分化誘導できる化合物スクリーニングを行う（分担者：冨田、他）。②ダイレクト・リプログラミングの適応拡大のため、アッセイのスモールスケール化をさらに進める（96-well plateを使用）。さらにポリシストロニックベクターを用い、スモールスケールでの網膜発生過程の再現に関する検証、分化レベルの検証を行う（世古、他）。③ゼブラフィッシュモデルと変性視細胞モデルの発現解析の結果を照合し、変性視細胞モデルの評価を行う（世古、他）。
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