2021 Fiscal Year Annual Research Report
Rejuvenation of mucosal immunosenescence by the sublingual vaccine: The prevention and treatment for periodontal disease and arteriosclerosis
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20H03856
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤橋 浩太郎 東京大学, 医科学研究所, 特任教授 (50820354)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 宏介 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (50283792)
中橋 理佳 東京大学, 医科学研究所, 特任講師 (80391887)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 舌下ワクチン / 歯周病 / サイトカイン / 抗原特異的IgA / 歯槽骨吸収 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高齢者における歯周病罹患率の増加は、それに起因する動脈硬化の発症も増加させ、健康長寿社会の構築を妨げる要因となる。そこで、歯周病の予防による動脈硬化のリスクマネージメントのみならず、すでに発症している歯周病の軽減と動脈硬化の治療を目的とした、粘膜ダブルシグナルシステム(CpG ODN/pFL,Flt3リガンドDNA発現プラスミド)を用いた高齢者のための舌下ワクチンの開発を目的とする。また、粘膜ワクチンは抗原特異的粘膜SIgA抗体に加え、血清IgG抗体も誘導する。そこで、歯周病及び動脈硬化の予防と治療におけるOMP40特異的、唾液中SIgA、歯肉溝浸出液中IgG、血清中IgG, IgA抗体の役割を解明することを第２の目標とする。本年度は、ダブルシグナルシステム(CpG ODN 20 μg/ pFL 250 μg)と歯周病菌であるPorphyromonas gingivalisの表面抗原であるOMP40(30 μg)からなる舌下ワクチンをC57BL/6マウス(雌)に１週おき４回投与し、P. gingivalisを口腔内感染させ歯槽骨吸収の変化を測定した。 舌下ワクチン投与群は、非投与群に比べて骨吸収が抑制されていることが明らかになった。 これらは今後の本計画の展開に重要な基礎データであり研究の遂行の観点から意義がある。次に、舌下ワクチンを投与したマウスのサイトカイン産生を解析したところ顕著なIL-17の産生が認められた。現在、動脈硬化の発症の予防効果について検証中であり、舌下ワクチンの動脈硬化予防効果について明らかにすることは、有効性を実証する上で大いに意義があり、重要課題である
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染症の拡大の影響により、pFLの精製に必要なギガキットの入手が困難となり、必要十分なpFLが得られず本研究の進捗に影響を与えた。抗原(30 μg/マウス)とダブルシグナルシステム(CpG ODN 20 μg/ pFL 250 μg)からなる舌下ワクチンをC57BL/6マウス(雌)に１週おき４回投与した。最終免疫より１、２週間後に唾液、血清を採取しOMP40特異的IgA,IgG抗体価が上昇していることをELISAにて確認した。そこで、最終免疫から２週間後にP. gingivalis381株(109 CFU)を14日間連続で口腔内投与し、投与終了から３週間後に骨吸収の変化を測定した。舌下ワクチン投与群は、非投与群に比べて骨吸収が抑制されていることが明らかになった。これらの結果はダブルシグナルシステムが粘膜アジュバントとして機能し、歯周病菌に対する特異抗体が歯周病の予防に関与していることが明らかになった。動脈硬化予防の先行実験としてダブルシグナルシステムを用いた経鼻ワクチンを投与することによって誘導されたIgMおよびIgA抗体が動脈硬化の予防に重要な役割を果たしていることを報告した(Vaccine, 40:1116, 2022)。次に、舌下ワクチン最終免疫より、１週間後に頸部リンパ節(Cervical lymph nodes, CLNs)と脾臓(Spleen, SP)より細胞を分離し、CD4+ T細胞が産生するIFN-γ, IL-4, IL-17を細胞内サイトカイン染色法用いてFACSで解析した。CLNsにおいて舌下ワクチン投与群では、非投与群に比べてIFN-γ, IL-4を産生するCD4+ T細胞の割合が増加傾向にあることが明らかになったが、SPでは同様な結果は認められなかった。さらに、IL-17を産生するCD4+ T細胞の割合はCLN, SPにて顕著な上昇が認められた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で用いた舌下ワクチンによって歯周病が予防が可能であることが示唆されたので、IgAKOまたはpIgRKOマウスモデル（若齢）を用いてIgA抗体の役割と歯肉浸出液中IgG抗体の役割について明らかにする。また、舌下ワクチン投与によって、高いOMP特異的抗体価を示した老齢・若齢マウスの血清をそれぞれプールし、IgG抗体、IgA抗体をカラム精製し、精製したそれぞれの抗体(100 μg)を２日おきに計６回、若齢ApoE-KOマウスに静脈投与する。初回投与の翌日より、P. gingivalis よる口腔内感染・骨吸収プロトコールを開始し最終感染より３週間後に動脈硬化発症の度合いを判定するコントロールとして非免疫マウスの血清より精製した抗体を用いる。
舌下ワクチンによる粘膜免疫誘導メカニズムを明らかにするために、老齢マウスの舌下DC(CCR5+, CCR6+)が活性化されMHC Class IIや副刺激分子の発現が高くなる事、舌下DCのCCR5発現が抑制され、CCR6単独陽性になる事をin vivo とin vitroで確認する。この時、宿主マウスのリンパ節におけるCCR6のリガンドであるCCL20の産生を検討する。
老齢マウスの顎下腺リンパ節CD4+ T細胞によるFoxp1発現が抑制される事をFACS解析にて明らかにする。抗原特異的CD4+ T細胞の初期誘導にはナイーブ細胞の活性が重要になる。そこで、老齢マウスの顎下腺リンパ節ナイーブCD4+ T細胞をコンジェニックマウスに移入し、その後、舌下免疫を行い、移入細胞のFoxp1発現が抑制され活性化エフェクターCD4+T細胞へと分化することを明らかにする。
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