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2021 Fiscal Year Annual Research Report

Molecular basis of the protein trafficking system for mitochondrial biogenesis and functional maintenance

Research Project

Project/Area Number 20H05689
Research InstitutionKyoto Sangyo University

Principal Investigator

遠藤 斗志也  京都産業大学, 生命科学部, 教授 (70152014)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 田村 康  山形大学, 理学部, 教授 (50631876)
Project Period (FY) 2020-08-31 – 2025-03-31
Keywordsミトコンドリア / TOM複合体 / SAM複合体 / クライオ電子顕微鏡
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、出芽酵母を中心にミトコンドリアの交通システムと品質管理システムについて、クライオ電子顕微鏡(EM)よる構造解析と構造に基づく生化学的・細胞生物学的解析を並行して進め、タンパク質の交通と品質管理に関する新たな原理を確立することをめざしている。今回は,ミトコンドリアの交通システムを構成する外膜のTOM複合体(ミトコンドリアへのタンパク質の搬入口として働く)とSAM複合体(外膜のβバレル型膜タンパク質の構造形成と外膜への組込みを担う)について,以下の結果を得た。
(1)TOM複合体は3分子のTom40を3分子のTom22が糊付けする形の3量体と、2分子のTom40から成りTom22を欠く2量体が動的平衡にあり,各々通過させる前駆体基質が異なり,後者はMIA経路の基質を主として通過させる。今回MIA経路のインポート効率が呼吸培地と発酵培地で大きく異なることがわかり,その原因となる膜間部および内膜に存在する因子候補を複数同定した。これらの因子は哺乳動物にも保存されており,酵母だけでなく哺乳動物ミトコンドリアにも共通するMIA経路のインポート効率の調節機構の存在が考えられる。
(2)SAM複合体については,SAM複合体上でTom40のような基質がどのようにβバレル構造を効率よく,かつ正確に作るのかを明らかにするために,酵母SAM複合体と基質Tom40のフォールディング中間体との複合体のクライオEM構造を決定した。並行して,in vivoジスルフィド結合形成を指標としてTom40のβバレル構造形成過程を構造形成の途中と完成した状態について明らかにした。これらの解析に基づいてSAM複合体よる基質のβバレル構造形成のメカニズムの詳細を解明し,論文発表した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

(1)ミトコンドリア外膜でミトコンドリアへのタンパク質の搬入口として働くTOM複合体は, TOM複合体は3分子のTom40を3分子のTom22が糊付けする形の3量体と、2分子のTom40から成りTom22を欠く2量体が動的平衡にあるが,これまでのクライオEMによる構造解析では3量体の「コア2量体」部分の構造のみが得られている。3量体の構造決定を目指し,3量体を安定化する方法を検討している。ノンストップミトコンドリアタンパク質を過剰発現してリボソーム-新生鎖-TOM複合体,そして可能であればTIM23複合体から成る超複合体を取得する方法,3量体構造をジスルフィド結合で安定化できるTom40とTom22のCys変異体を作成する方法などを検討した。さらに,2量体の主要経路であるMIA経路の活性が酵母を培養する培地に依存して大きく変わることを見出し,その原因となる因子候補を見出した。
(2)SAM複合体については,すでに基質のTom40がβバレル構造を形成するための反応サイクルのSAMの構成サブユニットが異なる2つの状態の構造を決定しているので,今回はβバレル構造を形成途上のSAM -中間体をSAMへの変異導入で安定化し,クライオEM構造を決定した。in vivoジスルフィド結合形成を指標として野生型SAM複合体上でもクライオEM構造と同様の中間体構造が形成されていることを確認し,決定した構造が変異導入によるアーテファクトでないことを証明した。
(3)ミトコンドリアを拡大する因子と経路については,ミトコンドリア量が増大するダイオキシックシフト時に発現量が増加するタンパク質Spg1の機能解析を進めている。さらにダイオキシックシフト時に拡大する核-液胞間コンタクト(NVJ)について,拡大に関与する新規因子も同定した。

Strategy for Future Research Activity

(1)すべてのミトコンドリアタンパク質の搬入口として機能するTOM複合体については,Tom22を含む2量体のクライオ電顕(EM)構造を決定済みであるが,三量体の構造はまだ決定できていない。三量体の存在は架橋実験の結果だけでなく原子間力顕微鏡の観察結果からも明かであるものの,三量体は不安定で,グリッド作成時には二量体に変換されてしまうことが問題であった。三量体のみを安定化する手法を検討中であるので,この実験系をスケールアップし,三量体を大量調製してクライオEMによる構造解析を目指す。(2)SAM複合体の動的構造変換と作動機構については,すでにSAM複合体-Tom40の構造形成中間体の構造決定に成功しているが,今回共同研究グループによって新規サブユニットが発見されたので,このサブユニットを過剰発現してこのサブユニットを含むSAM複合体を大量調製し,構造解析をめざす。(3)TOM二量体-三量体変換の機能的役割 については,二量体の基質である膜間部タンパク質のミトコンドリアへの取り込み量が呼吸条件下で増加することから,二量体が担うミトコンドリアタンパク質取り込みの活性を制御する因子の検索を行った。その結果いくつかの候補を得たので,それらの因子が膜間部へのタンパク質輸送経路,膜間部での酸化的フォールディングにおいてどのような働きをするのか,解析を進める。(4)出芽酵母のミトコンドリアを拡大する因子と経路については,ミトコンドリアが劇的に拡大するグルコース飢餓条件下で,核-液胞間のコンタクトサイトに特異的に集積するタンパク質の同定に成功したので,その因子の機能解析からミトコンドリア量の調節機構の詳細を明らかにする。

  • Research Products

    (16 results)

All 2023 2022 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (6 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 4 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 5 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] フライブルグ大学/ボン大学(ドイツ)

    • Country Name
      GERMANY
    • Counterpart Institution
      フライブルグ大学/ボン大学
  • [Journal Article] A multipoint guidance mechanism for β-barrel folding on the SAM complex2023

    • Author(s)
      Takeda H, Busto JV, Lindau C, Tsutsumi A, Tomii K, Imai K, Yamamori Y, Hirokawa T, Motono C, Ganesan I, Wenz, L-S, Becker T, Kikkawa M, Pfanner N, Wiedemann N, Endo T
    • Journal Title

      Nat Struct Mol Biol

      Volume: 30 Pages: 176-187

    • DOI

      10.1038/s41594-022-00897-2

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] ミトコンドリアタンパク質の輸送機構2023

    • Author(s)
      遠藤斗志也,竹田弘法,荒磯裕平
    • Journal Title

      実験医学

      Volume: 41 Pages: 664-675

  • [Journal Article] Dissociation of ERMES clusters plays a key role in attenuating the endoplasmic reticulum stress2022

    • Author(s)
      Kakimoto-Takeda Y, Kojima R, Shiino H, Shinmyo M, Korokawa K, Nakano A, Endo T, Tamura Y
    • Journal Title

      iScience

      Volume: 25 Pages: 105362

    • DOI

      10.1016/j.isci.2022.105362

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structural overview of the translocase of the mitochondrial outer membrane complex2022

    • Author(s)
      Araiso Y and Endo T
    • Journal Title

      Biophys. Physiol.

      Volume: 19 Pages: e190022

    • DOI

      10.2142/biophysico.bppb-v19.0022

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Role of the TOM Complex in Protein Import into Mitochondria: Structural Views2022

    • Author(s)
      Araiso Yuhei、Imai Kenichiro、Endo Toshiya
    • Journal Title

      Annual Review of Biochemistry

      Volume: 91 Pages: 679~703

    • DOI

      10.1146/annurev-biochem-032620-104527

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ミトコンドリアタンパク質の膜透過と膜組込機構2022

    • Author(s)
      遠藤斗志也,荒磯裕平,竹田弘法
    • Journal Title

      医学のあゆみ

      Volume: 281 Pages: 1151-1156

  • [Presentation] タンパク質の交通が制御するミトコンドリアプロテオスタシスの解明2022

    • Author(s)
      遠藤斗志也
    • Organizer
      タンパク質研究シンポジウム
    • Invited
  • [Presentation] Pathways and machineries that mediate and regulate mitochondrial protein trafficking2022

    • Author(s)
      Toshiya Endo
    • Organizer
      ISF Workshop: Mitochondria Past and Present - Evolution, Proteostasis, Dynamics and Disease
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Analysis of the import regulatory mechanism of mitochondrial IMS protein2022

    • Author(s)
      Haruka Sakaue, Toshiya Endo
    • Organizer
      EMBO Workshop on New Challenges in Protein Translocation across Membranes
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Protein machineries in transport and re-transport of mitochondrial proteins2022

    • Author(s)
      Toshiya Endo
    • Organizer
      EMBO Workshop on New Challenges in Protein Translocation across Membranes
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Protein machineries that make and maintain mitochondria2022

    • Author(s)
      Toshiya Endo
    • Organizer
      Mitochondria and Friends 2.0: Scientific Symposium Dedicated to the Memory of Walter Neupert
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ミトコンドリアの存在量を調節する分子機構の解明2022

    • Author(s)
      川上航平,後藤美稀,遠藤斗志也,田村康
    • Organizer
      日本生化学会東北支部第88回例会
  • [Presentation] 細胞内オルガネラ量の調節メカニズム2022

    • Author(s)
      田村康
    • Organizer
      第95回日本生化学会大会 シンポジウム オルガネラサーベイランスシステム:細胞がオルガネラの質と量を感知し 調節する仕組み
    • Invited
  • [Presentation] 出芽酵母におけるミトコンドリア膜間部タンパク質のインポート調節機2022

    • Author(s)
      阪上春花,遠藤斗志也
    • Organizer
      第95回日本生化学会大会
  • [Remarks] 遠藤研ホームページ

    • URL

      http://endolab.jp/wp/

URL: 

Published: 2023-12-25  

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