2020 Fiscal Year Annual Research Report
分岐鎖アミノ酸による網膜色素変性の新規進行抑制薬の開発
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20J40157
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
長谷川 智子 京都大学, 大学院医学研究科, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Keywords | 網膜色素変性 / 分岐鎖アミノ酸 / 神経保護 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、分岐鎖アミノ酸による神経細胞の細胞死抑制メカニズムを解明し、網膜色素変性の変性進行を鋭敏に反映するバイオマーカーを解明することで、分岐鎖アミノ酸による網膜色素変性に対する疾患進行抑制薬を開発することである。
まず、分岐鎖アミノ酸により、細胞内へのグルコースの取り込みが促進されているかどうかを明らかにするため、蛍光標識された2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)をHeLa細胞へとりこませ、Fluorescence-activated cell sorterを用いて、蛍光量を測定した。蛍光標識された2-DGは、グルコース同様、グルコーストランスポーターを介して細胞内へ取り込まれるが、分解されずに蓄積されるため、蛍光量がグルコースの取り込み量に比例する。HeLa細胞において、分岐鎖アミノ酸投与により、細胞内へのグルコースの取り込みが増強されることを明らかにした。
また、次年度への準備として、グルコーストランスポーターの細胞膜へのトランスロケーションの状態を解明するため、ウェスタンブロッティングおよびRT-PCRを用いて、培養細胞の細胞膜分画を用いたグルコーストランスポーターの発現量を検討するための系を確立した。さらに、クエン酸回路阻害剤UK5099を用いて、細胞内エネルギーと生細胞数を定量するための実験系を確立した。
また、網膜色素変性患者の視細胞変性や疾患進行抑制効果を鋭敏に反映するバイオマーカーを開発するため、静的量的視野検査や視力検査の各種検査値、光干渉断層計での黄斑部Ellipsoid zone長や中心窩網膜厚、中心窩外顆粒層厚の各パラメーターにつき、検査間変動の大きさや進行のスピードの比較を行った。黄斑部Ellipsoid zone長が、比較的検査間変動が小さく、網膜色素変性に対する薬剤開発を目指す治験での有用な指標になり得ることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年は、培養細胞を用いた実験を進め、分岐鎖アミノ酸によって細胞内へのグルコースの取り込みが促進されることを明らかにした。また、次年度への準備として、グルコーストランスポーターの細胞膜へのトランスロケーションの状態を解明するための系を確立し、また、クエン酸回路阻害剤負荷下での分岐鎖アミノ酸の細胞内エネルギー保持や細胞保護効果の有無を解明するための系を確立した。
さらに、網膜色素変性の前向き経過観察研究を推進し、静的量的視野検査や視力検査、光干渉断層計検査での各種パラメーターの比較を行い、光干渉断層計検査での黄斑部Ellipsoid zone長測定が、網膜色素変性の疾患進行をとらえやすい指標であることを明らかにした。また、申請者らが行っていた、網膜色素変性に対する分岐鎖アミノ酸の効果を検討するための医師主導治験（第Ⅱ相）は、令和2年度に予定通り終了し、現在解析中である。
これらの結果により、次年度も分岐鎖アミノ酸の細胞保護メカニズムの解明をさらに進め、分岐鎖アミノ酸による網膜色素変性に対する疾患進行抑制薬の開発を進めることができる環境が整ったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、1年目に得られた結果をもとに、培養細胞の細胞膜分画を分離し、グルコースの細胞内への取り込みを担うグルコーストランスポーターの発現状態を、リアルタイムPCRおよびウェスタンブロッティングにて解析する。分岐鎖アミノ酸投与の有無による、GLUTの細胞膜へのトランスロケーションの状態の違いを明らかにする。また、マウスの視細胞由来細胞株である661W細胞での分岐鎖アミノ酸投与による細胞内へのグルコースの取り込み状態の違いを解明する。さらに、1年目で確立した系を用いて、エネルギー産生の各段階やグルコーストランスポーターの阻害下での分岐鎖アミノ酸の効果を有無を検討し、分岐鎖アミノ酸の効果段階を解明する。
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