Cultivation and molecular biological analysis of copper reducing bacteria as for a copper recycling from low-grade metal ore

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05407
• Research Institution: Meijo University
• Principal Investigator: 細田 晃文 名城大学, 農学部, 准教授 (50434618)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 銅イオン還元 / 嫌気性細菌 / Shewanella科 / 次世代シークエンス / 酸化銅

Outline of Annual Research Achievements

本年度の研究では，申請者が構築した嫌気性銅還元マイクロコズムは河川汽水域底泥を接種源とし，銅板を入れた培養物を調製しバイアル瓶（２連×２×４処理区）のヘッドスペースを窒素ガスで置換した後，２５℃にて静置培養した。ネオキュプロイン法による銅（II）イオンの定量およびサイバーグリーン染色による菌数測定を各培養物に対して行い，銅イオンが減少した培養物のＤＮＡ抽出，１６S ｒＲＮＡ遺伝子（Ｖ４領域：古細菌および細菌を標的）のＰＣＲおよび次世代シークエンス解析を行った．滅菌処理を施していない４つの培養物（培養６０日）における菌数は，それぞれ３．６～４．５×１０^６ cells/mlまで増加し，銅板の周辺に沈殿物を生じた．この時の銅イオン濃度は約０．９ mMの減少であった．次世代シークエンス解析の結果，１つの培養物当たり約６２，０００リードの配列情報（銅イオンの変化が生じた６つの培養物からの平均値）が得られ，Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ科（５．０６%），Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎａｓ科（８．２４%），Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ科（４．０５％），Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ科（２４．１%），Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ科（７．０８%）などが優占化している（存在比３％以上）ことが分かった．一方，嫌気培養で優占化されやすいと考えられるメタン生成アーキアなどは存在比１%には満たなかった（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ科：０．２９%）また，ある培養物では，金属の還元能を有するＲｈｏｄｏｃｙｃｌａｓ科（２６．５%）や電流生産菌としてよく知られているＳｈｅｗａｎｅｌｌａ科（４５．５%）のみが優占化していた．また，培養中に生じた沈殿物をＸ線回折により解析した結果，酸化銅（ＣｕＯ）であることが示唆された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に従って，銅還元ができる嫌気性細菌の集積培養物（マイクロコズム）を得た．銅還元能力は1 mM程度と低いが銅還元マイクロコズムにおいて，１６S ｒＲＮＡ遺伝子を標的とした細菌群集解析を行った結果から，Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ科，Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｓ科およびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ科に属する細菌の優占化が確認された．これらの科に属する細菌には，鉄などをはじめとするいくつかの金属を還元する細菌が属するという報告があることから，培養物中の銅イオンの還元に関与していると推察された．また，銅イオン還元が認められた培養物中にのみ生成した沈殿物のＸ線回折結果から酸化銅が生成したことが明らかになったが，この生成反応が生物的あるいは非生物的であったかについては，明確な判断ができなかった．計画ではＵＮＳＷのMichael Manefield教授とデータ解析を行うため渡豪を予定していたが，コロナ禍のためオンラインでのミーティングにより結果に対する意見交換を行った．以上の結果より，本研究は概ね順調に進展していると判断した．

Strategy for Future Research Activity

次年度は，次世代シークエンス解析によって優占化していると考えられるＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ科，Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｓ科およびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ科のうち金属の還元能を有する細菌種の情報を検索し，それに基づいた各細菌種の最適培地を用い1 mMよりも高い銅イオン濃度にて，マイクロコズムの継代培養（馴養）を行う．同時にこれまでに得られた培養物における銅還元および生成した酸化銅の沈殿物が生物的反応によるものであることを証明するための培養実験（殺菌した接種源による培養など）も行う．これらの実験により銅還元細菌の単離を目指す．

Causes of Carryover

2020年度の4月から8月頃まで本学の入構制限があり，研究データ（次世代シークエンス解析）を得るための外部委託などができない状況が続いたため，当初予定していた研究進捗に若干の遅れが生じ，研究費用を当該年度内で使えなかった．この研究費については，次年度の次世代シークエンス解析または，培養物に生じた沈殿物のより詳細な解析を外部委託するために用いる予定である．