2020 Fiscal Year Research-status Report

Intracellular delivery of functional peptides and maintain of the activity by "peptide nucleic acid zipper" method

Research Project

Project/Area Number	20K05714
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	北松瑞生近畿大学, 理工学部, 准教授 (60379716)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ペプチド / ペプチド核酸 / 細胞内運搬ペプチド / オートファジー
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、活性を損なうことなく機能性ペプチドを細胞内へ運搬することを目的とする。そのためにペプチド核酸（以下PNA）を介して機能性ペプチドと細胞内運搬ペプチド（以下CPP）を連結-分離させる方法（PNAジッパー法）を開発する。本法によって運搬された機能性ペプチドの細胞内での活性を評価して、その有用性・汎用性を調べる。本法は細胞表面上ではなく細胞内の物質を標的にすることができ、その成果は革新的な医薬開発につながる。研究実施計画は、以下の3つの工程に分かれる。 ①ペプチド合成；機能性ペプチド修飾PNAおよびCPP修飾PNAをペプチド固相法により合成する。CPPはオリゴアルギニンとする。機能性ペプチドはオートファジー誘導ペプチドであるBeclin 1（Shoji-Kawataら、Nature 2013）などを用いる。また下記の評価のために種々のPNA鎖長を持つペプチドを合成する。 ②PNAの鎖長・配列の最適化；上記の配列は、水中で塩基配列特異的に1/1のハイブリッドを形成することが報告されている配列を参考とした（Romanelliら、Biopolymers 2009）。ただし本法において細胞外から細胞内で十分な連結-分離を生じさせるには、PNAの鎖長・配列のチューニングが必要であるので検討する。PNAのハイブリッド形成はUV融解曲線・蛍光スペクトルなどで評価する。またこれらの機器を用いて滴定曲線を得ることで結合定数を求め、ハイブリッド形成を定量的に解析する。 ③細胞内での活性評価；機能性ペプチド修飾PNAおよびCPP修飾PNAにそれぞれ発光波長の異なる蛍光基を修飾して共焦点レーザー顕微鏡により観察することで、細胞内での分離を評価する。また、その細胞内機能評価についても、これまでの研究者の報告（北松ら、Chem. Commun., 2015）に基づき、細胞死検出キットなどを用いて行なう。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度は、オートファジー誘導ペプチドを修飾したPNAと細胞内運搬ペプチドを修飾したPNAを合成した。これらは4,6,8,10,12量体のPNA鎖長を含んだペプチドである。これらの各組合せについてUV融解曲線および蛍光スペクトルによる蛍光滴定曲線から調べたところ、ある特定のPNA鎖長からハイブリッドが形成されることを見出した。さらにこれらの組み合わせのペプチドの一部を用いて細胞内導入を調べたところ、ある特定の鎖長以上のPNAで細胞内にオートファジー誘導ペプチドを運搬できることを見出した。これらのオートファジー誘導を予備的に確認したところある特定の組み合わせのPNA鎖長でオートファジー誘導が最大化することを見出した。またPNAジッパーに代わる、新しいペプチドジッパーについての検討を開始した。
Strategy for Future Research Activity	これらのPNAの全ての組み合わせに対する蛍光画像の観察を実施し、さらに全ての組み合わせのオートファジー誘導について確認したい。また、新しいペプチドジッパーについての検討を、このPNAジッパーと同様に始めていきたい。