2021 Fiscal Year Research-status Report
PINK1-Parkin経路の網羅的プロテオーム解析とミトコンドリア制御の解明
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20K06628
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小迫 英尊 徳島大学, 先端酵素学研究所, 教授 (10291171)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | PINK1 / Parkin / パーキンソン病 / ミトコンドリア / オートファジー / プロテオーム / ユビキチン化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物であるセリン/スレオニンキナーゼPINK1とユビキチン連結酵素Parkinが協調して損傷ミトコンドリアをオートファジーによって特異的に除去する分子機構の概要が最近明らかになった。しかしながら、従来の細胞生物学や分子生物学を基盤とする研究からは、その全体像を理解する上で十分な知見が得られていない。特にPINK1によって損傷ミトコンドリア上にリクルートされた活性化Parkinがユビキチン化する基質タンパク質を大規模に同定するためには、高度なプロテオーム解析技術が必須である。そこで本年度は、ごく最近開発されたUbiFast法（Nat Commun, 2020, 11, 359）を応用し、Parkinの基質を網羅的に同定することを試みた。Parkinを安定発現するHeLa細胞および親株のHeLa細胞に対し、無処理またはミトコンドリアの膜電位を低下させる脱共役剤で処理してから全細胞タンパク質を抽出し、トリプシン消化後に抗ジグリシン修飾リジン抗体固定化ビーズとインキュベートした。抗体ビーズに結合した状態でジグリシン修飾ペプチドを16種類のTMT (tandem mass tag) 16-plex試薬で標識し、洗浄後に混合してTMT標識ペプチドを溶出してLC-MS/MS解析を行った。その結果、4000種類以上のジグリシン修飾ペプチドの同定と定量に成功し、多数のミトコンドリア外膜タンパク質のユビキチン化が活性化Parkin依存的に増加することが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Parkinがユビキチン化する標的基質を大規模に同定するために、抗ジグリシン修飾リジン抗体固定化磁気ビーズを用いた高効率なペプチド免疫沈降、ビーズ上でのジグリシン修飾ペプチドのTMT標識条件の最適化、TMT標識ペプチドの高pH条件でのHPLCによる分画、および質量分析計を用いた多検体間での大規模比較定量解析のシステムを確立することができた。その結果、ミトコンドリアの損傷時に活性化Parkinによってユビキチン化されると考えられる基質候補を多数同定・定量することに成功した。この中には、ミトコンドリア外膜に局在する電位依存性陰イオンチャネルタンパク質であるVDACなどが含まれていた。この抗ジグリシン修飾リジン抗体固定化ビーズとTMT標識法を組み合わせたユビキチン化部位の大規模定量法は他のユビキチン連結酵素の標的基質の同定にも適用可能な汎用性の高い方法であり、本研究の進捗状況はおおむね順調と判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
ミトコンドリアの損傷時に活性化Parkinによってユビキチン化されるミトコンドリア外膜タンパク質の候補を多数同定することができたため、これらがParkinによって実際にin vitroおよびin vivoでユビキチン化されるか、またミトコンドリアの損傷に伴うミトコンドリアのオートファジーに関与するかをsiRNAノックダウンなどによって明らかにする。またクロスリンク質量分析法（XL-MS）によって、PINK1やParkinが損傷ミトコンドリア上で形成する複合体の構造を明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
抗ジグリシン修飾リジン抗体固定化ビーズとTMTpro-16plex標識試薬によってParkinの基質候補を大規模に同定する実験は、条件検討のために繰り返し行う予定であった。しかしながら、1度目の実験で最適な条件を見い出すことができたため、当該実験にかかる費用が当初予定よりも少なくなったため、次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した研究費とあわせて、新たに同定したParkinの基質候補の機能解析の費用に充当する予定であり、これらの解析を担当する技術職員の人件費等に使用することを計画している。
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