2022 Fiscal Year Research-status Report

Design of fluorescent probes for dynamic analysis of polysufides and proteins modified by polysulfidation

Research Project

Project/Area Number	20K07006
Research Institution	Hyogo Medical University
Principal Investigator	前田初男兵庫医科大学, 薬学部, 教授 (00229311)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	塚本効司兵庫医科大学, 薬学部, 准教授 (00454794)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ポリスルフィド / ポリスルフィド化タンパク質 / FRET型蛍光プローブ / 二波長型蛍光プローブ
Outline of Annual Research Achievements	前年までに、3’-O-(2-nitrobenzenesulfonyl)-fluoresceinがポリスルフィド（H2Sn, n≧2）蛍光プローブと機能することを見出している。しかし、細胞内のH2Snおよびポリスルフィド化タンパク質の動態を解析するためには、選択性だけでなく定量性のより高いレシオメトリーに資する蛍光プローブの開発が不可欠である。そこで、FRET型蛍光プローブの設計開発に着手した。その候補化合物として、まず、7-hydroxycoumarin-4-acetic acidとO-(2-nitrobenzenesulfonyl)-rhodolとの複合体1に着目した。クマリン部位の吸収波長335 nmを励起光として用いても1は蛍光を示さなかった。しかし、H2S2を添加すると、濃度依存的に540 nmの蛍光が増大し、FRET型蛍光プローブとして機能することを見出した。蛍光プローブ1はH2Sn以外の活性硫黄種や活性酸素種には応答を示さず、H2Snに対して高選択的であった。また、1のクマリン部位の水酸基をアセチル化した2は細胞内への透過性も高く、HeLa細胞内のH2Snを高感度に検出できた。しかし、1はFRET型蛍光プローブとして特性を有するが、レシオメトリーには利用できなかった。そこで、7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acidとO-(2-nitrobenzenesulfonyl)-rhodolとの複合体2を合成し、その蛍光特性を評価した。その結果、クマリン部位の吸収波長410 nmを励起光として用いると、2自身は470 nmに蛍光応答を示し、H2S2を添加すると濃度依存的に470 nmの蛍光が減少するとともに540nmの蛍光が増大した。つまり、2がFRET二波長型H2Sn蛍光プローブとしてレシオメトリーに活用できることが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason プローブ候補化合物の中からプロタイプ蛍光off/on型蛍光プローブ3’-O-(2-nitrobenzenesulfonyl)-fluoresceinを最適候補化合物として見出すとともに、その蛍光特性ならびに細胞系への適用性の検証に、COVID-19禍の影響を受け、予定したより時間がかかった。しかし、ポリスルフィド（H2Sn, n≧2）だけでなくポリスルフィド化タンパク質が複雑に関わるH2Sレドックスシグナルの動態解析に不可欠な蛍光レシオメトリーに利用できるFRET二波長型H2Sn蛍光プローブ7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid/O-(2-nitrobenzenesulfonyl)-rhodol複合体2の設計開発に思いの外早く成功した。その結果、当初の研究計画において実施できていない項目は、FRET二波長型H2Sn蛍光プローブの実用性の検証と同プローブによるポリスルフィド化タンパク質の可視化計測だけである。したがって、1年延長した研究期間内に予定通りに研究計画を遂行できると考えている。
Strategy for Future Research Activity	FRET二波長型H2Sn蛍光プローブ7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid/O-(2-nitrobenzenesulfonyl)-rhodol複合体2のポリスルフィド（H2Sn, n≧2）、ポリスルフィド以外の活性硫黄種および活性酸素種に対する応答性を検証し、2のH2Snに対する選択性を検証する。この検証過程において、選択性について改善すべき問題があった場合は、プローブ設計を再検討し、より選択性の高いFRET二波長型H2Sn蛍光プローブを設計開発する。H2Snに対する高い選択性を担保できるFRET二波長型H2Sn蛍光プローブについてポリスルフィド化タンパク質の可視化測定への適用性を検証するとともに、クマリン部位の水酸基をacetyl化することにより細胞膜透過型・FRET二波長型H2Sn蛍光プローブを開発し、その細胞内H2Snレドックスシグナルの動態解析に適用可能なレシオメトリーを確立する。
Causes of Carryover	FRET二波長型ポリスルフィド蛍光プローブの設計開発にあたり、思いの外、候補化合物を合成する必要がなかったため、合成試薬などを購入する必要がなかったため、次年度使用額が生じた。次年度は、設計開発したFRET二波長型ポリスルフィド蛍光プローブを用いたポリスルフィドの動態解析に資するレシオメトリーを確立するために、当該助成金を適正に使用する。