Development of a primate model for analysis on replicating and dormant liver stages using transgenic fluorescent Plasmodium cynomolgi

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07465
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 川合 覚 獨協医科大学, 医学部, 教授 (70275733)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 宗裕 京都大学, 霊長類研究所, 教授 (70177096) ; 案浦 健 国立感染症研究所, 寄生動物部, 主任研究官 (90407239)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 三日熱マラリア原虫 / Plasmodium vivax / サルマラリア原虫 / Plasmodium cynomolgi / 肝臓内休眠体 / 可視化 / GFP / ルシフェラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

マラリアは熱帯・亜熱帯を中心とした地域に広く分布しており、いまもなお年間２億人以上の有病者と、40万人以上の死亡者を数える重要感染症のひとつである（WHO Malaria Report 2018）。5種類のヒト・マラリアのうち、特に三日熱マラリアは、致死率は高くないものの、東南アジアを中心に流行地域が存在し、最も対策の困難なマラリアと言われている。それは、三日熱マラリアの原因原虫であるPlasmodium vivax (以下Pv)のもつ特有の発育過程に起因している。Pvは媒介蚊からヒトへ侵入後、肝臓内で一部の原虫が休眠体を形成する。休眠体は初期症状を治療した後も肝臓内に残存し、休眠体を根治しない限り再発を繰り返すことが知られている。したがって、三日熱マラリアの撲滅には休眠体に対する対処方法がカギとなる。しかしPvの休眠体は完全に再現される培養系が確立されておらず、一般的な動物実験に使われるネズミマラリア原虫でも休眠体が形成されないことから、いまだ多くの基盤情報が未知のまま残されている。一方、サルマラリア原虫のP. cynomolgi（Pcy）は、Pvとゲノム配列の相同性が90%以上と系統的に最も近縁の原虫種で、休眠体の形成や赤内期の増殖サイクル等、生物学的性状も極めて類似している。そのため欧米の研究機関では、Pcyを肝臓休眠体のin vivo モデルとして古くから用いている。近年、研究代表者らはニホンザルとPcyを用いた肝臓休眠体疾患モデルの作出に取り組み、国内で初めてin vivo 実験系の確立に成功した。そこで、本研究では肝臓休眠体の休眠期および再活性化に必須の分子メカニズムを明らかにすることを目的に、遺伝子導入によるPcy可視化株の樹立を目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験用アカゲザルを3頭（R1～R3）準備した。これらの動物にはマラリアの感染感受性を高めるために、実験前に脾臓摘出術を施した。1頭目のサル(No. R1)に凍結保存したPcy感染血液を静脈内接種した。感染12日後、Pcyの赤血球感染率が1～２%程度に達した時点で5mlをヘパリン加採血した。No. R1は採血後、クロロキン硫酸塩5㎎/kg/日を5日間筋肉内投与し、マラリアに対する治療を施した。No. R1の感染血液から遠心分離した赤血球を用いて5%赤血球浮遊液/RPMI培地を調整し、ミックスガス・インキュベータ内にて振盪培養を行った。約24時間後、成熟分裂体（シゾント）に発育したタイミングで、それらをNycodenz法により濃縮回収し、電気穿孔法でDNAコンストラクトを導入した。本研究で導入するDNAコンストラクトにはピリメサミン耐性マーカー（hdhfr）とGFP::Luc（GFPとルシフェラーゼの融合遺伝子）を組み込んだ。遺伝子導入したPcyは速やかにNo. R2へ静脈内接種する。接種10日～12日後、末梢血液中にPcy感染赤血球が確認された時点でピリメサミン水溶液（1mg/kg）をサルへ経口投与した。ピリメサミンの投与6日後、No. R2は深麻酔下で心臓穿刺による全採血を行い、採取した感染血液は凍結保存血液を作製するとともに、一部をNo. R3へ静脈内接種した。静脈内接種から10日後、R3で増殖したPcyを蛍光顕微鏡で観察したところ、明瞭なGFPシグナルが認められた。これら一連の実験により遺伝子導入されたPcy可視化株が樹立されたことになる。

Strategy for Future Research Activity

前年度に樹立したPcy可視化株の凍結保存血液は、新たな実験用アカゲザル（No.R4）に接種し、赤血球感染率が0.5～1.0%に達した時点で、先と同様の方法により心臓穿刺による全採血を行う。No. R4から採取した感染血液は人工膜吸血法でハマダラカに吸血させる。吸血21日後、感染ハマダラカを解剖して唾液腺を取り出し、唾液腺内スポロゾイトに対するGFP::Lucリポーターアッセイを行う。Pcy可視化株SPZは滅菌PBS内に回収し、初代ヒト培養肝細胞（LH TK-NOG 細胞）と混合培養しin vitro で肝細胞への侵入性および発育の初期段階を観察する。また、Pcy可視化株SPZは実験用アカゲザル（No.R5）に接種し、作製されたPcy可視化株が実験用サルの肝臓内に休眠体を形成し、一定期間後に再発することを証明する。No.R5は再発が確認された時点で剖検に処し、肝臓組織標本を作製する。これらの肝臓組織標本を用いて、特異抗体を用いた免疫染色（抗GFP抗体や抗マラリア原虫抗体など）を施し、肝臓内の休眠体を組織化学的に確認する。

Causes of Carryover

当初の予定では、実験用アカゲザルを前期に3頭、後期に3頭、合計6頭を導入する予定であった。しかしながら、前期の3頭を導入した後、新型コロナ肺炎の影響により、該当サルの移動禁止処置がとられ、導入することができなかった。したがって、導入できなかった3頭分の検疫経費、飼育管理経費、技術支援経費等に繰越金が発生した。また本実験では、研究代表者および共同研究者が在籍する獨協医科大学（栃木県）、国立感染症研究所（東京都）、京都大学霊長類研究所（愛知県）と、実験の実施場所である基盤研・霊長類医科学研究センター（茨城県）を連携させるために十分な旅費を計上していた。しかし、これも新型コロナ肺炎の流行のため県境を越えた出張の自粛要請が発令され、当初の予定より出張回数が少なく、旅費および消耗品等の物品費に繰り越し金が発生した。次年度は、新たな実験用アカゲザルを6頭導入することにより、種々の経費に繰越金を充当する予定である。