2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of glycolipid recognition mechanism in intestinal tissue invasion of Aeromonas and its application study
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20K07504
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| Research Institution | Hiroshima International University |
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Principal Investigator |
小林 秀丈 広島国際大学, 薬学部, 講師 (70441574)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Aeromonas / 糖鎖認識 / 腸管上皮 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スフィンゴ糖脂質（GSL）は糖鎖が細胞表面に露出し，菌体や細菌毒素の受容体としての機能が報告されている．本研究ではGSLの糖鎖構造が，腸管感染細菌であるAeromonasによって認識され，感染症の進展に寄与しているのかについて解析を行う．
本年度は以下の研究項目について検討した。(1) ABO糖鎖発現腸管上皮細胞株の樹立 (2) ABO糖鎖認識Aeromonas株のスクリーニング
(1) ABO式血液型に関わる糖鎖はGSLの中でも合成遺伝子が明らかになっており，腸管上皮細胞でも発現していることが知られている．H型物質を産生する腸管上皮細胞にA, B糖転移酵素遺伝子をそれぞれ導入し，AおよびB抗原を発現する細胞株の樹立を試みた．今回使用した糖転移酵素遺伝子はJosep Carreras Leukaemia Research InstituteのFumiichiro Yamamoto主任研究員より分与いただいた．遺伝子導入細胞をAS ONE Cell Picking Systemによりシングルセル単離・培養を行い，AおよびB抗原のみを発現する細胞株をそれぞれ樹立した．
(2) 上記で樹立した細胞株に種々のAeromonasを感染させ上皮バリア透過能を測定した．発現する糖鎖構造の違いにより透過能が異なる菌株のスクリーニングを実施した．
Aeromonasによる感染症はしばしば重症化するが，疾病などでも変化することで知られているGSLの糖鎖構造に着目して，菌が特定の糖鎖構造を認識して組織移行性を高めているのではないかと考えた．本研究で得られた知見はAeromonasの糖鎖認識と重症化機構の解明につながる可能性が期待される．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Aeromonasの腸管上皮侵襲にGSLの糖鎖構造の認識が関わるのか検討を行った．腸管上皮細胞にAおよびB糖転移酵素遺伝子をそれぞれ導入し，AおよびB抗原のみを発現する細胞株を樹立した．導入した遺伝子には緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子が含まれており，GFP産生細胞をAS ONE Cell Picking Systemによりシングルセルを単離した．単離した細胞を培養し，AおよびB糖鎖抗原に対する抗体を用いた免疫染色により目的糖鎖の発現を確認した．さらに，樹立した腸管上皮細胞をトランスウェルに培養し，経上皮電気抵抗値（TER）の測定ならびにタイトジェンクション構成分子であるZO-1の抗体による免疫染色を行った．その結果，今回樹立した細胞は遺伝子導入前の細胞と同程度のTER値を示した．さらに，タイトジェンクションへのZO-1の局在も観察され，樹立した細胞は上皮バリア機能を有していることが明らかになった．
上記で樹立した細胞にAeromonasを感染させ上皮バリア透過能を測定した．トランスウェルに培養した細胞のアピカル側に菌を感染させ基底膜側への菌の移行量や上皮への定着能を測定した．現在，研究室に保存されたAeromonasより糖鎖認識に関わる菌株のスクリーニングを実施している最中である．スクリーニングにより選抜された菌株を用いて糖鎖認識機構の解析につなげる予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度から引き続きABO糖鎖認識Aeromonas株のスクリーニングを進め，糖鎖認識株の選抜を目指す．糖鎖認識株が選抜されれば，糖鎖認識株と非認識株についてゲノム解析を実施する．両菌株のゲノムを比較することで，糖鎖認識に関わる責任遺伝子の同定を目指す．同定された遺伝子のクローニングならびに遺伝子を欠損させた菌株を作製して糖鎖認識への影響について解析する．トランスウェルに培養した細胞のアピカル側に遺伝子欠損株を感染させ，基底膜側への菌の移行量や上皮への定着能を野生型菌株と比較する．糖鎖認識に関わる責任遺伝子が同定されれば，糖鎖認識機構の解析を目指す．
本研究でAeromonasの糖鎖機構や糖鎖構造が明らかになれば，特定の糖鎖を固定化した樹脂を作製し，菌を除菌できる装置の開発を試みる．再生セルロースなどに糖鎖を結合させた装置に溶液を循環させ，細菌を取り除くという試みは既に病原大腸菌の除菌を目的とした装置で開発が進められており，本研究でもAeromonasの認識糖鎖の構造が明らかになれば実施可能と考える．Aeromonasによる重症化した場合に問題となる敗血症の治療において，本装置を透析装置に連結させ用いることで血液内の菌を速やかに除くことができると期待している．また，Aeromonasは魚類感染症の原因菌であり，養殖魚や観賞用の魚への病気が問題となっている．本装置を水循環装置へ連結させて，水中の菌の除菌にも応用できる可能性もあり，そういった分野への貢献が期待できる．
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| Causes of Carryover |
物品の価格が変更されたため、一部残金が生じた．次年度の物品費として適切に使用する計画である．
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