Application of a gene expression visualization system to analyze cancer stem cell generation

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K08101
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 小川 良平 富山大学, 学術研究部医学系, 准教授 (60334736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鍵谷 豪 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (30524243) ; 趙 慶利 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (90313593) ; 渡部 明彦 富山大学, 学術研究部医学系, 講師 (20377253)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: がん細胞 / CRISPR-Cas9 / 上皮間葉転換

Outline of Annual Research Achievements

今年度はEカドヘリン遺伝子の下流にDsRedの遺伝子を相同組換えで導入するプラスミドを構築し、これまで実施した実験をこのプラスミドで再度実施した。相同組換え領域を上流側、下流側ともに少しずらして長くした。また、2A配列付近の接続が設計通りであることを配列分析によって確認した。このプラスミドベクターをOct4の下流に2A配列を介してEGFPを発現するLNCaP細胞に導入し、新たな二重組み換え細胞の構築をおこなった。この細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として、組換え細胞構築に使用した相同領域外の配列とゲノム中に新たに導入した遺伝子の配列を利用したPCRを行い、構造の確認もおこなった。
作成したこの組換えLNCaP細胞にEカドヘリンに対するsiRNAを導入して発現をノックダウンしたところ、DsRedの蛍光の抑制も観察されたが、ウエスタンや定量的なPCRで解析したEカドヘリン発現の程度とは一致しなかった。また、Eカドヘリンの発現量が大きくノックダウン（>80%）した状況でもOct4下流のEGFPの発現はほとんど変化が見られなかった。
DsRedもEGFPも半減期が長く（>1日）、非常に安定なタンパクであることが知られている。蛍光を測定したのはEカドヘリンをノックダウンを開始して24~72時間の間である。したがって、それぞれのタンパクの発現低下は始まっていたかもしれないが、うまく検出できなかった可能性もある。現在、継続的に100時間以上Eカドヘリンのノックダウンをおこない蛍光タンパクによる蛍光を測定する実験を試みている。また、より半減期の短い蛍光タンパクも知られており今後はそれらの使用も検討したい。また、EカドヘリンのCRISPR-Cas9による遺伝子失活の影響についての検討も始めている。
研究は予定よりも大きく遅れてまだ完成していないが、今後も機会を見て継続的に検討していきたい。