2020 Fiscal Year Research-status Report
p53の機能獲得変異を標的とした食道扁平上皮癌に対する治療法開発
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20K08390
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
佐々木 泰史 札幌医科大学, 医療人育成センター, 教授 (70322328)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 食道扁平上皮癌 / p53 / 機能獲得変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
予後不良な消化器癌である食道扁平上皮癌ではp53変異が高頻度に認められるが，変異p53自体は治療標的とはならず，有効な分子標的薬も存在しない．本研究では，p53の機能獲得（GOF）変異に着目し， p53ネットワークにかかわるトランスクリプトームの全容をゲノム情報を駆使して効率的に分析し，機能解析へと展開する．さらに発現異常，遺伝子変異の有無，悪性度および治療効果との関連性を解析することで，食道癌の新しい診断・治療効果予測システムを開発しようとするものである．ゲノム情報に基づいたがんの個別化医療の理想に近づく基礎研究を目指す．
本年度は以下の研究成果をあげた。
１）血液中を流れる患者特有のがん由来DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）について、NGS、およびデジタルPCRを用いた超高感度検査を確立し、食道扁平上皮患者診療における実用性を明らかにした。
２）106名の子宮頸癌根治的放射線治療患者の治療前生検FFPE組織から409がん関連遺伝子のアンプリコンシークエンスを行い、PIK3CA（36.8%）、ARID1A（35.8%）、NOTCH1（28.3%）等、高頻度変異遺伝子を同定した。また、FGFR familyに変異を有する群では有意に再発が多いことを見出した。
３）12の組織由来の79種類のヒトxenograftモデルについて、全エクソン解析を行い、9種類の抗癌剤の感受性に関連する162のバリアントを同定した。
４）免疫チェックポイント阻害剤nivolumab治療後に救済化学療法を行った口腔扁平上皮癌2例のゲノム解析を行い、治療効果との関連性を考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）凍結癌組織、非癌部組織、リンパ球を検体いただき、DNA, RNAを抽出済みの症例36例，FFPE癌組織33例に加え、今年度は新規症例19例のDNA, RNAの抽出を行い，p53，およびがん関連遺伝子の変異を解析した．
２）DNA結合能，転写活性化能，および腫瘍原性解析から，GOF活性を評価した変異型p53発現プラスミド，またはアデノウイルスベクターを作成した．細胞株に導入し，発現レベルのチェックを行った．
３）上記プラスミド，アデノウイルスベクターを複数の食道癌細胞に導入し，全RNAを抽出し，クオリティチェックを行った．
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| Strategy for Future Research Activity |
１）次世代シークエンサーを用いて，変異型p53のGOFによって変化するトランスクリプトームを抽出する．非コードRNAを含むトランスクリプトの食道扁平上皮癌組織での発現をISH法，qRT-PCR法を用いて解析し，臨床病理学的因子（脈管浸潤、リンパ球浸潤、リンパ節転移、遠隔転移など），治療抵抗性，予後との相関の有無から，バイオマーカーとしての有用性を検討する．
２）変異型p53のGOFによって発現が低下するトランスクリプトはがん抑制的に機能することが予想されるので，癌細胞株・組織における遺伝子異常を解析する．逆に発現上昇するトランスクリプトはがん遺伝子的に機能することが予想されるため，組織における発現解析に重点を置く．
３）発現誘導系，および発現抑制系を構築して，機能解析を行う．特に細胞増殖，アポトーシス誘導能，細胞運動能，浸潤能への影響について詳細に検討する．
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| Causes of Carryover |
本年度は癌症例のRNA-seq（タンパクコード遺伝子・lincRNA），small RNA-seq（miRNA）の予備的解析（細胞株のトランスクリプトーム）を行い，クオリティの検証が中心となったため，物品費の節約が可能であった．大学予算の試薬を使用できたため，充分な実験データが得られた．最終的に100万円あまりの次年度使用額が生じた．
＜使用計画＞
施行済みの次世代シークエンサー解析，およびp53結合コンセンサス配列の全ゲノム網羅的解析から，p53に制御される非コードRNAの候補を同定している．成果の一部を学術誌Molecular and Clinical Oncologyに投稿し，revisionの判定がなされた．再投稿に必要な追加実験を予定するとともに，次年度は研究を発展させるため，癌症例（食道癌，関連疾患として口腔癌）における発現解析，血漿中の発現を解析することにより，消化器癌の新しい診断・治療システムの構築も試みる．関係学会が開催された場合，成果発表を予定している．
細胞レベルでの発現・転写解析のための試薬類（次世代シークエンス試薬120-150万円），臨床検体でのRNA発現解析のための試薬類（酵素類20万円，RNAプローブ20-30万），学会出張旅費15万円：日本癌学会（場所横浜，2021年9月30日-10月2日），日本分子生物学会（場所横浜，2021年12月1日-12月3日）
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