2021 Fiscal Year Research-status Report

肺癌治療において分子標的治療薬が惹起する薬剤性肺障害の発症機序の解明とその克服

Research Project

Project/Area Number	20K08555
Research Institution	Hyogo Medical University
Principal Investigator	南俊行兵庫医科大学, 医学部, 講師 (00705113)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	木島貴志兵庫医科大学, 医学部, 教授 (90372614)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	薬剤性肺障害 / ドライバー遺伝子変異・転座陽性肺癌 / 癌微小環境
Outline of Annual Research Achievements	肺癌の内科的治療成績は、近年の分子標的治療の進歩により劇的に改善した。その一方で、分子標的治療薬は致死的な薬剤性肺障害（Interstitial lung disease: ILD）を惹起する事も少なくない。本研究の目的は、分子標的治療薬によるILDの発症機序を解明し、その制御法を確立する事である。申請者らは肺癌細胞と腫瘍関連マクロファージ（Tumor-associated macrophage: TAM）との相互作用に着目している。ドライバー遺伝子変異陽性肺癌症例に対する小分子阻害剤は奏効率も高く、無数の肺癌細胞をapoptosisやsenescenceに導く事ができるが、その際には大量のDamage-associated molecular patterns (DAMPs)やSenescence-associated secretory phenotype (SASP)が放出されると考えられる。これらのDAMPsやSASPによるTAMの活性化が「炎症」と「線維化」の両方に関わり、ILDを惹起すると考え、そのKeyとなる分子として転写共役因子YAP/TAZに注目した。これまでの解析で、Epidermal growth factor receptor (EGFR)遺伝子変異陽性肺癌細胞をEGFR-Tyrosine kinase inhibitor（TKI）に曝露するとYAP/TAZが核内に移行すること、同時にCytokine arrayの結果からはTAMのrecuruitmentに関与するCCL2などのchemokineがSASPとして放出される事を確認した。現在、これらのSASPがYAP/TAZによるregulationを受けるかを、EGFR遺伝子変異陽性肺癌細胞のYAP/TAZ knockout（KO）細胞を樹立して解析を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本年度は、ドライバー遺伝子変異の一つであるEGFR遺伝子変異陽性肺癌細胞を使用したin vitroの解析を引き続き行なった。 EGFR遺伝子変異陽性肺癌細胞をEGFR-TKIで刺激した所、YAP/TAZの核への移行が促進される事が確認され、同時にprofibrotic mediatorであるCTGF, TGF-β2などが誘導されることが判明した。さらに、YAP/TAZ-TEADのinteraction阻害薬であるverteporfinによりこれらの誘導が抑制される事が確認された事で、確かにYAP/TAZ経路がこれらprofibrotic mediatorはYAP/TAZの経路を経て誘導されている事が判明した。同時に、Cytokine arrayの結果からは、TAMの分化や遊走に関わるchemokineの発現が上昇している事が判明し、EGFR遺伝子変異陽性肺癌においてEGFR-TKIで加療した結果生じたSASPが、確かに癌細胞とTAMの間を繋ぐメッセンジャーになり得る事が示唆された。またYAP/TAZを制御することで、EGFR-TKIによって惹起されるSASPもまた制御することが可能かを検証するために、EGFR遺伝子変異陽性肺癌細胞のYAP/TAZをCRIPSR/Cas9システムを用いてKOした細胞を樹立した。現在この細胞を用いての解析を進めているが、同時にⅡ型肺胞上皮細胞A549についても同様のYAP/TAZ KO細胞の樹立を試み、これを作成することができた。そこで、EGFR-TKIがEGFR遺伝子変異陽性細胞に影響を与え、TAMを介在してILDを惹起しているのか、それとも肺胞上皮に対して直接影響を及ぼす事が、ILDの原因となっているのかも検証している。
Strategy for Future Research Activity	3年目はin vitroの解析をさらに進めると同時に、in vivoの解析も行う予定である。マウス肺癌細胞3LLにEGFR遺伝子変異を導入してtransformationさせた細胞をヌードマウスの皮下に移植し、EGFR-TKIで治療を行なった上で腫瘍を摘出し、SASPの誘導状況や癌周囲組織のTAMや線維化の評価を行う。最終的にはYAP/TAZの阻害剤による治療実験を行い、実臨床において、TKIによって惹起される線維化が、YAP/TAZの制御で抑制されるかを検証する。これらin vivoでの実験と並行して、間質性肺炎合併肺癌症例の臨床検体の集積と解析を進めていく。このために必要な実験計画書は既に当院の倫理審査委員会を通過しており、現在、検体の集積中である。評価項目についてはin vitroの解析で判明した分子を優先的に解析する。
Causes of Carryover	（理由）今年度はYAP/TAZのKO細胞を作るのにやや手間取り、in vitroの実験が主となっため、細胞や試薬については既に研究室に備蓄されていたものを有効に使用する事ができた結果、新規の購入などが、予想以上に少なくて済んだ事で、差額が生じる結果となった。（使用計画）次年度は、動物実験やヒト臨床検体の免疫染色での解析を行うことを想定していて、動物の購入・飼育費、検体の解析に使用する抗体および試薬の使用量が大きく増加すると思われ、差額分を含めた研究費を使用させて頂く予定である。