2021 Fiscal Year Research-status Report

乳歯歯髄幹細胞培養上清由来因子を用いた新規皮膚炎治療法の検討

Research Project

Project/Area Number	20K08690
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	橋本登徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (90712365)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	加納史也徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (40801626) 杉浦一充藤田医科大学, 医学部, 教授 (70335032)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	炎症性皮膚疾患 / Atopic dermatitis / 乾癬 / Siglec-9 / 抗炎症 / 皮膚バリア
Outline of Annual Research Achievements	ヒト歯髄幹細胞培養上清(SHED-CM)において同定された分泌型Siglec-9(sSiglec-9)による炎症性皮膚疾患に対する抗炎症・皮膚バリア再生効果を検討するために以下の検討を行った。卵白アルブミン(OVA)誘導アトピーマウスに対しsSiglec-9の尾静脈投与をおこなった。その結果、sSiglec-9投与群では対照群に比べ、皮膚の肥厚や肥満細胞の誘導を抑制し抗炎症効果があることが示された。次に、sSiglec-9のターゲット細胞を明らかにするために次の実験を行った。イミキモド誘導乾癬マウスを作成し、脾臓を抽出しT細胞とマクロファージに対するsSiglec-9の結合性を評価した。その結果、幹線発症マウスではCD3+CD4-T細胞、M0、M1マクロファージに結合性が亢進していた。現在、結合時における薬理活性の解析を行っている。 Siglec-9のリガンド糖鎖キャリアタンパクの同定を行うために、細胞溶解サンプルにSiglec-9-Fcを加えProtein A beadsでpull-downした産物に対し、そのタンパク成分のLC/MSによる網羅的解析を行った。マクロファージ様細胞RAW264.7の膜表面タンパク質をビオチン化しSiglec-9-Fcと比較用Siglec-Fc (Siglec-E, Siglec-6, Siglec-15)を用い免疫沈降を行い結合分子の分子量情報を得た。これらの結果からSiglec-9特異的に結合する３つの分子を同定した。マウス骨髄由マクロファージに対し３分子に対する特異的な抗体を用いウエスタンブロッティングを行ったところ同様な結果が得られたことからこれら３分子はSiglec-9が特異的に認識するマクロファージに共通している分子であることが示唆された。これら3つの分子の意義を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Siglec-9のターゲット細胞の同定を進めている。T細胞、マクロファージ共に炎症発症時に特徴的にSiglec-9の結合性が亢進することが分かった。特にマクロファージでの結合がより強くなることから、単球系の細胞により強く関与することが示唆されている。Siglec-9結合タンパクの同定においても3つのタンパク質を同定した。現在それら3分子のマクロファージにおける機能を解析しており、Siglec-9結合による機能分子を見出すことで炎症性皮膚疾患の新規制御法の創出ができる可能性が高い。これまでに報告のなかったアトピーマウスでのsSiglec-9の効果を新たに発見したことからおおむね順調に進展していると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	これまでの研究によりSiglec-9とマクロファージをはじめ単球系細胞に対する機能制御が主となっていることが示唆されている。皮膚炎においてsSiglec-9は種々の炎症性サイトカインを抑制していることはわかっているが、マクロファージの極性の変化、他の単球系への影響、ヘルパーTの分化制御はまだ不明瞭な点が多い。B細胞、好中球、樹状細胞、肥満細胞、表皮細胞は皮膚炎において病態関連の細胞であり、sSiglec-9の標的になりうるため解析する必要がある。sSiglec-9のマクロファージとT細胞制御、さらにB細胞や樹状細胞、表皮細胞等への影響を体系的に解析し、細胞上の結合分子および作用メカニズムを明らかにする必要がある。皮膚バリアの維持にはFilaggrinの正常な発現が寄与している。sSiglec-9投与マウス表皮のFilaggrin 発現をreal time PCR法および抗体染色により解析する。また、ビオチンを皮膚部に塗布し、その膚透過量で皮膚バリアの構造評価を行うことができる。そこで、治療、未治療群のビオチン取り込みをavidin染色により評価する。 TNFaやIFNgによりHaCaT細胞のThymus and activation regulated Chemokine (TARC)が誘導される。TARCの発現は皮膚バリアの崩壊につながる。sSiglec-9がTARC発現抑制可能かどうかを検討する。その際、Filaggrin以外の皮膚バリア因子であるTight Junction関連分子の発現解析、さらにセラミド合成への影響を薄層クロマトグラフィー法による脂質解析を行う。
Causes of Carryover	(理由)Siglec-9標的分子として同定した分子の種類が想定よりも多くなり、当該年度はその絞り込みのために培養細胞レベルの実験を多くし、研究計画の動物モデル実施時期を次年度にした。 (使用計画)次年度はSiglec-9標的分子として同定した分子の遺伝子操作とSiglec-9相互作用の意義の解析に試薬等が多く必要になると予想され次年度使用額が生じた。次年度研究費(皮膚炎モデルマウスに対するSiglec-9の作用機序の解明)と合わせた使用計画である。