2020 Fiscal Year Research-status Report

Research on the mutual paracrine effect by MMP-9 and sCD154 between CD40 positive ESCC cells and platelets

Research Project

Project/Area Number	20K09000
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	佐々木勝則北海道大学, 医学研究院, 学術研究員 (60336394)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	平野聡北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813) 七戸俊明北海道大学, 医学研究院, 准教授 (70374353) 土川貴裕北海道大学, 大学病院, 講師 (50507572) 中村透北海道大学, 医学研究院, 助教 (70645796)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	CD40 / CD154 / MMP-9 / 食道がん / 血小板
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、CD40陽性食道扁平上皮癌（ESCC）が産生・分泌するMMP-9が腫瘍周囲の細胞外マトリックスを消化・分解する作用のみならず、活性化血小板に作用し、CD154（CD40 ligand）のshedding に寄与することで、sCD154とMMP-9が介在するmutual paracrine effectによる癌悪性化のスパイラル・モデルを証明するものである。初めに、4種類のESCC細胞株（CD40陽性株：TE-5およびTE-10、CD40陰性株：TE-4およびTE-11）を可溶化型CD154 （sCD154としてMEGACD40Lを用いた）で刺激し、MMP-9 mRNAおよびproteinの変化を定量した。sCD154刺激24時間後のMMP-9 mRNA量の変化は、CD40陽性株TE-5で45倍、TE-10で20倍とそれぞれ有意に増大した。一方、培養上清中に分泌されたMMP-9 proteinの変化は、CD40陽性株TE-5はもともと検出限界未満だったのが検出可能となり、TE-10では6倍と有意に増加した。さらに、gelatin zymographyにて分泌されたMMP-9 proteinの形状はそのほとんどがproMMP-9であった。sCD154刺激による細胞増殖能には変化はなかったが、CD40陽性株TE-5の遊走能、浸潤能はそれぞれ2.4倍、1.5倍増強した。同じくTE-10の遊走能、浸潤能はそれぞれ3.0倍、4.3倍と増強した。CD40陰性株TE-4およびTE-11はsCD154刺激によるMMP-9 mRNAおよびproteinの量的変化ならびに遊走能、浸潤能の機能には影響しなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CD40陽性癌細胞に対するsCD154刺激はapoptosisを誘導することから、相反する効果であるsCD154刺激による増悪効果を研究することは困難であった。しかし、本研究で対象とするCD40陽性ESCC細胞株は、sCD154刺激による細胞増殖抑制は認められなかった。その一方で、2種類のCD40陽性株はsCD154刺激によるMMP-9 mRNAならびにproteinの産生増加、細胞の遊走能、浸潤能の増強を示した。反対に、CD40陰性ESCC細胞株はsCD154刺激によるMMP-9 mRNAおよびproteinの量的変化ならびに遊走能、浸潤能の機能的変化は認められなかった。このように、CD40-CD154 interactionによるMMP-9産生増加、遊走能、浸潤能の増強を示すことができ、1年目に予定していた研究項目を計画通り進めることができた。
Strategy for Future Research Activity	3年計画の1年目はCD40陽性ESCC細胞株を中心に研究を進め、順調に結果を得ることができた。2年目は、血小板に焦点を合わせ、（１）分離した血小板をThrombinにて活性化した後、ESSC細胞株の培養上清（有機水銀化合物APMAにて培養液中のproMMP-9を活性化する）あるいはrecombinant human MMP-9 (active form)を添加し、活性化血小板から培養上清中へのCD154の分泌をELISA（Human CD40 Ligand /TNFSF5 Quantikine ELISA Kit, R&D systems）法にて定量する。さらに（２）MMP-9刺激後の活性化血小板培養上清を用いてCD40陽性ESCC細胞のMMP-9 mRNA変化をTaqMan Gene Expression Assayにて定量する。これら2年目の研究結果とすでに得られている1年目の研究結果とを合わせることで、本研究の目的である、CD40陽性ESCC細胞と血小板との間を液性因子、sCD154とMMP-9が介在するmutual paracrine effectによる癌悪性化のスパイラル・モデルを提唱することが可能となる。