Prediction of cancer microenvironment using deconvolution analysis

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09068
• Research Institution: Kanagawa Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 笠島 理加 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 副技管・主任研究員 (20630875)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井元 清哉 東京大学, 医科学研究所, 教授 (10345027) ; 廣島 幸彦 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 医長 (60718021) ; 山口 類 愛知県がんセンター(研究所), システム解析学分野, 分野長 (90380675)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: Virtual dissectionモデル / がん微小環境 / 膵癌

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、がん細胞のゲノム情報とがん細胞を取り巻く微小環境のゲノム情報を合わせることでがんゲノム医療の精度を大きく向上させることである。具体的には、臨床で使用可能なバルクのがん組織を用いたRNA sequencing (RNA-seq) データを数理的に各細胞グループに分離、分析する新規Virtual dissection モデルを構築し、臨床での実装化を目指す。自施設の膵癌切除検体を用いたバルクRNA-seq、Single cell RNA-seq (scRNA-seq)の各データと膵癌PDX モデルを用いたインタラクトーム解析の結果を統合し、NMF 法、Deconvolustion 解析、CIBERSORT など様々な数理モデルを用いて、新規Virtual dissection モデルの構築を行う。また、TCNG（The Cancer Network Galaxy（ベイジアンネットワークによるがん統合分子ネットワークデータベース））を合わせることで、on-tumor でpathogenic に働いているがん-間質相互作用を同定することが可能となり、がん細胞と微小環境の両方を対象にした次世代がんゲノム医療の実現を目指す。
2021年度は、主としてモデルの構築およびバリデーション検体のデータ取得を行なった。膵臓組織は酵素を多く分泌する組織であり、作業工程中に細胞が死に安いため、質の高い膵癌細胞のデータを得るために４例の膵癌患者のオルガノイドの作成を行い、それらのバルクRNA-seq、scRNA-seqを行った。また、オルガノイドの元となった原発巣の膵癌組織およびその膵臓の正常組織からRNA-seqおよびWhole Exome Sequencing (WES)を行った。オルガノイドと元の膵癌との比較解析も行い、がん細胞と微小環境の相互作用の検討を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2021年度は、Virtual dissection モデルの構築および検証データとして必要な患者由来サンプルにおけるデータセットの取得を主に行なった。
使用するscRNA-seqのデータ取得には生存率が高い活きの良い細胞を使用することが不可欠である。一般的に膵臓組織は酵素を多く分泌する組織であり、作業工程中に細胞が死んでしまいやすい。様々な組織から細胞を単離する方法は考案されているが、それらの理由から、生存率の高い活きの良い細胞を得るのは困難である。さらに、がん細胞や正常の膵臓細胞や間質細胞を一つ一つにバラバラにするのが大変難しい組織の一つである為、当初の予定を変更し、膵癌組織からモデル系の一つであるオルガノイドを作成することで、患者由来膵癌細胞とすることにした。よって、膵癌モデルの患者オルガノイドに対してscRNA-seqを行った。加えて、同じオルガノイドのバルク状態のサンプルとオルガノイドの元となった膵癌患者の原発巣と正常の膵臓のRNA-seqとWESを行いデータの取得を行なった。患者組織の採取、オルガノイドの作成、RNAやDNAなどの核酸抽出およびscRNA-seqのライブラリ合成は自施設で行なった。抽出した核酸は外部委託業者に提出し、RNA-seqとWESを行い配列データの取得を行なった。外部受託により取得した配列データは分担研究者と共に次のように加工した。RNA-seqの配列データは発現量のデータおよび融合遺伝子などの臨床所見と比較可能なデータに変換した。WESの配列データは患者の遺伝子変異情報を抽出し、臨床所見と比較可能なデータに変換した。scRNA-seqの発現量のデータは発現量のデータおよび臨床所見と比較可能なデータに変換した。上記のことから、概ね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

(１)前年度で取得しきれなかった未取得の膵癌オルガノイドのバルクRNA-seqとWESの配列データの取得を行う。
(２) Virtual dissection モデルの構築とDiver interaction の同定： Public data として、膵癌だけでなく、多くの癌腫におけるscRNA-seqのデータやバルクのRNA-seqおよびWESなどのデータが登録されている。昨年度に引き続き、Public dataや膵癌PDX、手術検体から得られたデータをNMF 法、Deconvolution 解析、CIBERSORT などの数理モデルを用いて、発現量の分解を行い、モデルを構築する。これまでの主流なモデルに加え、異なるモデルの開発も進んできている為、それらの手法も考慮する。
また、本モデルによる解析結果とTCNG を統合し、治療標的候補となるがん-間質相互作用を同定する。また、膵癌PDX の症例については、インタラクトーム解析も平行して行い、TCNG の結果と比較検討する。尚、膵癌PDX では免疫不全マウス（NSG マウス）を使用しているため、免疫細胞に関する情報がなく、正常細胞についてもマウス細胞であるため、移植源組織のデータを用いて補正を行う。
(３) Virtual dissection モデルの検証：(２)で同定したDiver interaction に関する候補分子群について、同一検体の免疫組織化学を用いて、発現量と発現細胞について検証する。検証された分子については、膵癌200 症例のTissue microarray (TMA)を用いて臨床病理学的因子との関連を検討する。

Causes of Carryover

当初自施設でのリース予定にしていたシークエンス機器による配列データの取得も外部委託以外にも予定していたが、配列取得は全て外部委託で行うことに変更した。その為、物品費として計上していた予算をその他の外部受託費として使用することに変更した。
４症例の膵癌モデルであるオルガノイドにおけるscRNA-seqを行った。しかしながら、症例ごとに作成されたオルガノイドの状態はそれぞれ異なる。その為、サンプルによっては一度に回収できるサンプルが異なるため、２サンプルは十分に一度に回収することができなかった。よって、２症例の膵癌患者オルガノイドのバルクRNA-seqとWESのデータ取得が、サンプル量が足りなかった為にできていない。よって、これらのデータ取得を行うために2021年度の予算の一部を次年度に使用することにした。

Research Products

• [Presentation] Prediction of specific pathways in high grade fetal lung adenocarcinoma using gene network analysis (2021)
  • Author(s): Rika Kasajima, Masaki Suzuki,Eigo Shimizu, Yoshinori Tamada, Atsushi Niida, Rui Yamaguchi, Yoichi Furukawa, Satoru Miyano, Seiya Imoto,Tomoyuki Yokose, Yohei Miyagi
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会