2020 Fiscal Year Research-status Report

創傷治癒過程における皮膚創部の酸化ストレス耐性獲得機構の解明

Research Project

Project/Area Number	20K09856
Research Institution	Hyogo Medical University
Principal Investigator	河合建一郎兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (80423177)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	久保盾貴大阪大学, 医学系研究科, 教授 (00362707) 藤原敏宏兵庫医科大学, 医学部, 講師 (00423179) 西本聡兵庫医科大学, 医学部, 教授 (30281124) 石瀬久子兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30567194) 垣淵正男兵庫医科大学, 医学部, 教授 (50252664)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	創傷治癒 / 酸化ストレス
Outline of Annual Research Achievements	創傷治癒に影響を与える因子の一つとして酸化ストレスがある。酸化ストレスは組織障害を引き起こす“悪玉論”で語られることが多いが、酸化ストレスの主体であるROSはシグナル伝達（ROS/Redoxシグナル）にも利用されており、実は生理的に重要な働きも持つ。創部は酸化ストレスの大きい部位であるが、創部において生体がいかに酸化ストレスを避けつつROS/Redoxシグナルを利用しているかは不明である。本研究では酸化ストレスに応答するメカニズムとして、Ca2+チャネルの一種であるTRPC3に着目する。皮膚線維芽細胞がTRPC3を介して組織における酸化ストレスに感応し、酸化ストレス耐性を獲得することで組織修復へ導くメカニズムを解明する。レトロウィルスを用いたTRPC3過剰発現細胞およびそのコントロール細胞は作成しストック済みである。本研究ではこれに加えてCRISPR Cas9システムを用いてTRPC3ノックアウト細胞を作成し、各種assayを行う計画となっている。以前作成したTRPC3過剰発現細胞は長期間ストックされていたため、性質に変化がないか以前のデータを再現できるかを予備実験として行い、大きな性質の変化がないことを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究以外の業務が増加したことに加え、長期間使用していなかった機器（ピペット、Western blotに使用する泳動槽やパワーサプライなど）がいくつか故障しており、それらを修理もしくは新たに購入する必要があったが、コロナによる物流の停滞でなかなか機器が納品されないということも何度か続いた。上記の状態の中、TRPC3過剰発現細胞は長期間ストックしていたため、これが以前の通りの性質を保っているか確認する必要があり、データの再現性が取る実験に時間をとられた。
Strategy for Future Research Activity	今後行う実験としては、①　TRPC3ノックアウト線維芽細胞の作製、②酸化ストレスに対するTRPC3陽性細胞の反応性の観察、③創部でのTRPC3陽性線維芽細胞の発現とクリアランスの観察、④ 細胞構成物の酸化度の観察、⑤ TRPC3陽性細胞の酸化ストレス耐性の観察、⑥Gタンパクの酸化修飾についての解析、⑦ストレス応答キナーゼシグナルの調査、⑧TRPC3作動薬、阻害薬のマウスへの投与実験、⑨ヒト慢性創傷での確認　を予定している。②以下は①のノックアウト細胞が必要となるため、まずCRISPR Cas9システムを用いてTRPC3ノックアウト細胞の作成を急ぐ。ノックアウト細胞の作成がうまくいかなかった場合は過剰発現細胞のみを用いて②以下を行う予定である。
Causes of Carryover	機器の不具合などがあり今年度計画していた実験が計画通りに遂行できなかったため。次年度に必要な試薬や消耗品の購入を予定している。