2021 Fiscal Year Research-status Report
レット症候群原因遺伝子CDKL5の神経細胞分化時におけるリン酸化機構の解明
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20K15751
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
片山 将一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 助教 (60779049)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | CDKL5 / プロテインキナーゼ / シグナル伝達 / P19胚性腫瘍細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5)はセリン／スレオニンアミノ酸残基をリン酸化するタンパク質リン酸化酵素である。CDKL5遺伝子の変異はてんかんや精神発達の遅れを伴う疾患を引き起こす。かつてこの疾患はMethyl-CpG2-binding protein 2を原因遺伝子とするレット症候群の亜型とみなされていたが、症状の違いなどから、最近ではCDKL5特有の疾患としてCDKL5欠損症と定められている。CDKL5遺伝子が変異し、CDKL5欠損症を発症するそのメカニズムを明らかにするためには、CDKL5をとりまくシグナル伝達経路を見出すことが必須の課題となる。しかしながら、これまでにCDKL5がリン酸化する基質やCDKL5の機能を制御するタンパク質の情報は非常に少ない。そこで、研究代表者は、CDKL5をリン酸化し機能調節を行うタンパク質リン酸化酵素を探索するため、タンパク質リン酸化酵素に対する阻害剤ライブラリーを使用し、CDKL5をリン酸化するタンパク質リン酸化酵素としてKinaseXを見出している。さらにKinaseXによってリン酸化されるCDKL5のアミノ酸残基について解析を行ったところ、KinaseXはCDKL5のC末端領域に存在する複数のアミノ酸残基をリン酸化することが明らかになった。また、CDKL5が神経分化過程において、そのリン酸化状態が変化すること、ならびに細胞死を制御することを見出した。また、細胞内におけるCDKL5のリン酸化がその機能にどのような影響を与えるかを解析するため、簡便なCDKL5の酵素活性検出法の開発にも取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
所属機関の異動により研究に遅れが生じた。また、LC-MS/MSで決定したKinaseXによるCDKL5の推定リン酸化部位に対してAlaに置換した点変異体を作製したが、それらの部位はこれまでの実験で見出していた細胞内でのリン酸化部位と一致していなかった。そのため、CDKL5の欠損変異体や点変異体を作製し、CDKL5の細胞内においてリン酸化されるアミノ酸を改めて決定した。これらの事からやや研究に遅れが生じたと判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、改めて決定したCDKL5のリン酸化部位変異体を用いて、細胞死の制御能に変化が見られるかを解析する。具体的には、これまでに見出したCDKL5のKinaseXによってリン酸化されるアミノ酸を、それぞれAlaもしくはリン酸化を模したアミノ酸であるAspおよびGluに置換したCDKL5点変異体を発現するP19細胞株を作製する。これらの変異体のうち細胞死に変化が見られるものを探索する。細胞死に変化が見られる変異体を同定できた場合には、その変異がCDKL5の触媒活性等に及ぼす影響を解析する。特に触媒活性の測定は研究代表者らによって確立された新規手法を利用する。
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| Causes of Carryover |
(理由)
本年度の研究において必要なオリゴDNAの受注が予定より少額で賄えたため、次年度使用額が生じた。
(使用計画)
次年度においては、より多くの変異体作製のため、DNAポリメラーゼの購入やオリゴDNA発注がより必要となることが予想される。そのため次年度研究費(物品費)と合わせて使用する予定である。
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