筋収縮関連遺伝子群を利用した上皮組織の厚み制御機構の研究

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15802
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 瀬戸 裕介 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (40738481)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 眼組織 / オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、眼組織オルガノイドの分化誘導に適したロットの試薬（基底膜マトリックス）を入手することができず、当初の計画にあったTagln遺伝子のレポーターES細胞から作製した眼組織オルガノイドからのATAC-seqを予定通り実施することが困難であった。そのため、Tagln遺伝子の発現を制御する上流シグナルについて、各種の阻害剤を用いて探索を行った。なお、阻害剤を用いたスクリーニングにおいても、眼組織オルガノイドを利用することが困難であったため、実際のマウス胚の頭部の器官培養を行うことで代用を試みた。
マウス胚において、眼組織の著しい形態変化が起きる直前のタイミングである胎生9.5日目から、形態変化が起こり、Tagln遺伝子が発現している最中の胎生10.5日目までの約24時間、マウス頭部の培養を行なった。培養時に、各種の試薬を添加することにより、組織の形態変化およびTagln遺伝子の発現に及ぼす影響について免疫組織化学的な解析を行った。解析の結果、まず、今回行った実験の条件では、網膜組織が正常に換入しない個体が多いことが分かった。そのような状態のサンプルにおいては、眼組織において本来Tagln遺伝子が発現するRPE領域ではなく、本来発現しないはずの神経網膜領域において、その発現が確認できた。このことは、組織が本来の自発曲率とは異なる曲げ状態になった時にTagln遺伝子の発現が誘導される可能性を示唆している。また、このときのTagln遺伝子の発現はSRFの阻害剤であるCCG-1423での処理によって著しく減弱した。また、ROCK阻害剤のY-27632でも同様の減弱がみられたことから、細胞骨格系を通じた歪みの感知がTagln遺伝子の発現を制御している可能性が考えらえれる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、これまでの実験に使用していた基底膜マトリックスの流通が、昨年度途中から引き続き、厳しく制限されていた影響により、眼組織のオルガノイドを用いる実験を当初の予定通り実施することが困難であった。そのため、予定していたATAC-seqを実施することができなかった。そこで、マウス頭部の器官培養系を用いたTagln遺伝子の上流シグナル解析を行うことにした。頭部の器官培養系においては、組織の変形状態に応じて、Tagln遺伝子の発現領域が変動することを見出した他、各種の阻害剤を用い流ことにより、実際のマウス胎児の眼組織において、Tagln遺伝子は組織の歪身を細胞骨格系を通じて感知することにより発現が制御されている可能性を見出すことができたため、上記の区分とした。

Strategy for Future Research Activity

昨年度から引き続き、組織の分化に適した基底膜マトリックスの入手が困難な状態が続いているため、眼組織オルガノイドの安定的な作製が難しい状況が続いている。そこで、次年度においては、実際のマウス胚の眼組織から個々の細胞を単離してATAC-seqを実施し、Tagln遺伝子を含む筋収縮関連遺伝子のゲノム領域近傍の状態を解析することを計画している。
また、マウス胚の眼組織の器官培養系を改良することにより、正常に組織が貫入する確率を高め、RPEでのTagln遺伝子の発現についても、SRFなどが重要であるか、阻害剤の添加やドミナントネガティヴ変異体の過剰発現実験などを行い、検証することを計画している。
一方、これまで利用していた基底膜マトリックスと同等の他社製品で手に入りやすいものについて、眼組織オルガノイドの分化に適したものがあるか調べる作業を並行して行い、適したものが見つかればレポーター細胞を用いた解析を実施したいと考えている。

Causes of Carryover

購入を予定していた試薬の一部が、キャンペーン等により当初の予定よりも安く購入できたため。
次年度、オルガノイド作製に用いる試薬の購入費として使用する。