Bioengineering of functional bladder substitute using tissue decellularization and autologous derived bladder cells

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17552
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 出口 幸一 大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (00747082)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 再生医療 / 膀胱再生 / 細胞外マトリックス / 細胞培養 / 脱細胞化

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞外マトリックスに膀胱由来細胞を播種することで組織を三次元的に再構築し、移植可能な人工膀胱組織を作成することを目標としている。本年度は、足場となる細胞外マトリックスとヒト尿路上皮細胞を組み合わせて、機能的な三次元膀胱組織を作成するプロトコールの確立を行った。
1. 脱細胞化マトリックスの準備：細胞外マトリックスは、昨年確立した幼若ブタ由来脱細胞化膀胱組織を使用した。脱細胞化はDET法１サイクルで行い、組織内遺残薬剤を十分に洗浄除去したのちに、gamma irradiation法で滅菌を行った。本滅菌法により細菌が死滅し、培養液内に静置しても細菌感染が起こらないことを確認した。
2. 細胞外マトリックス上播種培養法の確立：細胞外マトリックスをScaffodex CellCrownと呼ばれる器材に装着することで、スナップウェル培養（培養を2つのコンパートメントに分割し、それぞれに培地を添加して培養する方法）が可能となり、安定したマトリックス上細胞播種が可能となった。脱細胞化膀胱マトリックスの内腔側が、スナップウェルの上面を向くようにマトリックスをCellCrownに設置し、培養は12-well plateを用いて行った。
3. 培養方法の確立：培養したヒト由来尿路上皮細胞をスナップウェル上に播種した。主に検討した播種条件としては、1）播種細胞数、2）播種細胞の分化状態である。1)に関しては、通常の細胞培養細胞数である2 x 10^5 cells/cm2で生着することが確認された。尚、細胞播種後の細胞活性の評価はMTT assayを用いて行い、細胞カバー率を顕微鏡下に計測した。2)に関しては、expansion phaseでは非常に良好な細胞接着がみられた一方、differentiation phaseでは細胞の多くが接着せず浮遊してしまう結果となった。これらの結果から、expansion phaseでマトリックス上に細胞を播種し、その後分化誘導を行う方法をとることとした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

脱細胞化マトリックス上に細胞播種を行う条件検討に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

細胞外マトリックス上に細胞播種を行い、継続培養することで生着することが確認された。適切な細胞と細胞数を用いれば、目的の細胞外マトリックスをほぼ全域にわたってカバーする播種を実現できることが確認できた。今後の進展としては、細胞外マトリックスへの播種後に、膀胱上皮細胞を機能分化させ、本細胞の主要機能であるバリア機能を確立することであり、細胞分化法を検討する。以上の結果を統合し、ex vivoで移植可能な機能性膀胱組織の確立を目指す。

Causes of Carryover

計画の遅延により当初本年度に予定していた実験を次年度に行うこととなったため次年度使用額が発生した。次年度の実験費として使用予定である。