PATはどのように生着するのか？～三次元血管構築と免疫細胞群の解析～

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18426
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 山内 大輔 久留米大学, 医学部, 助教 (80529496)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: PAT / 血管の可視化 / 三次元再構築 / 透明化標本作製 / LEA / CUBIC / 二光子励起顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

近年、Perifascial areolar tissue(PAT)を用いた難治性潰瘍治療が多く報告されている。PATは豊富な血管網を持ち、遊離移植で良好に生着する。また腱・骨露 出部の肉芽形成 のない創床や感染創にも生着しうることが特徴である。しかし、このような殆ど血行のない創傷に生着する機序や感染に抗い生着できる理由について組織を解析した研究報告は少ない。本研究では、PATに血行再開するまでの組織内の経時的変化、容易に生着しやすい性質持つ PATの三次元血管構築の解明、および創傷治癒遅延モデルにおけるPAT移植組織を解析することを目的としており、より安全な術式を確立するとともに、PATを用いた治療法の適応拡大に貢献することを目指している。
2020年度は、透明化PAT組織の三次元血管網解析を行なった。この実験系では、ラットおよびヒトPATを採取し透明化処理後に生体深部イメージング技術で血管網の三次元構築を明らかにすることを目的とした。事前のトライアルでは、ラット試料ではCUBICを用いた透明化処理及び蛍光標識したトマトレクチン(LEA)を用いた血管系の描出が可能であった。同様の手法で、ヒト難治性潰瘍治療の際に生じた余剰PAT組織を採取し(n=3)、CUBICで透明化処理後LEA染色を施した。ヒトPATはラットPAT と比較すると、試料に厚みがあったために透明化試料作製に時間を要した。また、LEAによる染色自体は可能であったが、二光子顕微鏡で三次元的な画像撮影を行うためには、試料の厚さを調整する必要性があることがわかった。
2021年度は、Fresh cadaverからPATを採取し試料全体の透明化標本作製を試みた。試料のボリュームが大きいため、シリコーンゴムを注入充填し、PAT内部の血管を可視化する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度の進捗が遅れた理由としてはヒト生体試料の入手が困難であったことである。しかし、本年度はFresh cadaverから試料を採取することにしたため、予定のサンプル数を入手する見込みが立った。全体の進捗は遅れているが、試料の解析を随時解析を進めているところである。また、ラット組織に比較してヒト組織は大きいため、透明化、染色法に改良の余地が生じたが、問題点を抽出できたため、本年 度は血管の描出法を変更して解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

Fresh cadaverを用いた透明化PAT組織の三次元血管網解析を進める。CUBICを用いた透明化処理後に、試料の一部はトマトレクチン(LEA)で染色を施し、生体深部イメージング技術 で血管網の三次元構築を明らかにする。また、試料全体には、血管内にシリコーンゴムを注入充填し、PAT内部血管の可視化を試みる予定である。ヒト試料を用いた解析は手術の予定に計画の進捗が左右されるので、Fresh cadaverを用いた解析を優先的に進める予定である。

Causes of Carryover

予定より試料の解析が進まなかったために次年度使用額が生じたが、現在は改良した手法および別の試料でも解析を進めており、次年度は研究を予定通り進められる見込みであ る。