PATはどのように生着するのか？～三次元血管構築と免疫細胞群の解析～

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K18426
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 山内 大輔 久留米大学, 医学部, 助教 (80529496)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: PAT / CUBIC / 二光子励起顕微鏡 / 血管構造の可視化 / 三次元再構築 / 透明化標本作製 / LEA

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、容易に生着しやすい性質持つ PAT（Perifascial areolar tissue）の三次元血管構築の解明を目的としており、より安全な術式を確立するとともに、PATを用いた治療法の適応拡大に貢献することを目指している。 2020年度は、透明化PAT組織の三次元血管網解析を行なった。この実験系では、ラットとヒトからPATを採取し透明化処理後に生体深部イメージング技術で血管網の三次元構築を解析した。事前のトライアルでは、ラット試料ではCUBIC(clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis）試薬を用いた透明化処理及び蛍光標識したトマトレクチン(LEA)を用いた血管系の描出が可能であった。しかし、ヒト PATでは試料に厚みがあったため透明化試料作製に時間を要した。また、LEAによる染色自体は可能であったが、二光子顕微鏡で三次元的な画像撮影を行うためには、試料の厚さを調整する必要性があることがわかった。2021年度以降は、Fresh cadaverからPATを採取して試料全体の透明化標本作製を試みているが、二光子顕微鏡で観察を行うには、透明化した試料を透明な状態を保持したままゲル化して固定する必要がある。CUBIC試薬とアガロースゲルの至適濃度を探索するため、2022年度以降はヒト生体のPAT余剰組織を用いて、CUBIC-1(FUJIFILM CUBIC TRIAL KIT)とCUBIC-L(TCI CUBIC KIT)の２種類で透明化標本を作製した。2%アガロースゲルでCUBIC試薬ごと試料を固形化することで、透明性を維持したまま蛍光標識でラベルした試料を二光子顕微鏡で観察を行えることを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ヒト組織では脳以外の脂質の多い組織における透明化プロトコルが確立していない。また、 不定形の試料を観察したい場合は、観察対象が浮遊・移動しないように溶媒ごと試料をゲル化する必要がある。CUBIC試薬には複数の製品が存在するため、不定形試料の深部観察に最適化した透明化技術の選択と透明化・ゲル化のプロトコル確立に時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

これまで、CUBIC試薬を用いてプロトコル通りに組織の脱脂・透明化を行なっても透明化標本が得られなかった。しかし、ヒトPATでの透明化標本作成のプロトコルを確立し、蛍光標識した試料をゲル化することにも成功した。そこで、次年度は二光子励起顕微鏡を用いてサンプルの解析を行う予定である。

Causes of Carryover

脂質の多いヒトPATでの透明化プロトコルの確立およびゲル化の至適濃度の確定までに時間を要したため。次年度は得られた試料の顕微鏡観察を行うため、残額は殆どないが研究遂行には問題ないと考えている。