細菌の非コードRNAの作動原理の解明と創薬への展開

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21281
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 沼田 倫征 九州大学, 農学研究院, 准教授 (10401564)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 非コードRNA / リボスイッチ / 遺伝子の発現調節 / 細菌 / PreQ1 / tRNA / 化学プローブ / クロスリンク

Outline of Annual Research Achievements

リボスイッチは細菌に特有の非コードRNAである。多くのリボスイッチはmRNAの5’非翻訳領域に存在しており、リボスイッチの下流にコードされた遺伝子産物によって生合成・輸送される低分子リガンドと特異的に結合して、当該下流遺伝子の発現を転写もしくは翻訳レベルで調節する。これらリガンドの多くは、核酸塩基、核酸誘導体、補酵素などであり、細菌の生育にとって不可欠であるものが多い。つまり、リボスイッチは、これら細菌の生育に不可欠なリガンドの生合成や輸送に関わるタンパク質・酵素の発現を調整する重要なRNAエレメントである。したがって、リボスイッチに結合しその機能を阻害する合成化合物は、RNAを標的とした新規な抗生剤の候補物質となり得る。
一方で、生体内には機能未知の非コードRNAが数多く存在している。バクテリアやアーキアといった原核生物においても機能が解明されていない非コードRNAが存在する。さらに、真核生物ではその数が膨大である。これら機能が理解されていない非コードRNAの機能を解明することは科学的に重要であることはもちろん、ヒューマンヘルス分野においても重要な研究課題である。本年度は、リボスイッチの一種であるpreQ1リボスイッチを対象として、それに結合するpreQ1の化学構造を基盤にした化学プローブを合成し、preQ1と相互作用するRNAの探索を目指した。ジアジリンを有したpreQ1誘導体プローブを合成した。この化学プローブがperQ1リボスイッチと特異的に結合し、UVの照射でリボスイッチとクロスリンクすることが明らかとなった。また、化学プローブとリボスイッチとの複合体の結晶構造を決定し、ジアジリン側鎖の有無に関わりなくpreQ1と類似した様式でリボスイッチに結合することが判明した。さらに、ヒト細胞由来の転写物と混合し、本化合物と特異的に結合するRNAを同定することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに、preQ1リボスイッチと結合しその下流遺伝子の転写を抑制する合成化合物を、低分子化合物マイクロアレイを用いたスクリーニングによって同定していた（Nat. Commun. 2019）。さらに、この合成化合物（親化合物）の化学構造を基盤にした第2世代の化合物を合成し、転写抑制活性が亢進した2種類の誘導体を取得するとともに、それらとリボスイッチとの複合体の結晶構造を決定することに成功していた。本年度は、preQ1の化学構造を基盤とした化学プローブを合成し、preQ1と相互作用するRNAの探索を目指した。まず、16種類の化学プローブを合成した。UVを照射した結果、ジアジリンを有したpreQ1誘導体が効率よくperQ1リボスイッチとクロスリンクすることが明らかとなった。この誘導体化学プローブとリボスイッチとの複合体の結晶構造を決定した結果、ジアジリン側鎖の有無に関わらずpreQ1と類似した様式でリボスイッチに結合していた。さらに、in vitroにおける転写抑制活性を測定した結果、preQ1と比較して若干劣るが、当該化学プローブもまた効率よく下流遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった。さらに、大腸菌破砕液中においても、当該化学プローブがperQ1リボスイッチとクロスリンクしていた。以上から、この化学プローブを利用することにより、preQ1と結合する未知の非コードRNAの同定に利用できる可能性が示唆された。そこで、当該化学プローブをヒト細胞破砕液と混合して、UV照射に伴いクロスリンクするRNAの有無を検討した。その結果、幾つかのRNAを同定することに成功した。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究から、preQ1の化学構造を基盤とした化学プローブを使用して、preQ1と結合する非コードRNAの同定が可能であることが示唆された。今後、クロスリンク実験で同定したRNAに関して、preQ1との相互作用解析や機能構造解析を行う計画である。本手法は、機能未知の非コードRNAの機能解析に応用できる可能性が期待される。さらに、他の低分子リガンドを基盤とした化学プローブを合成・利用することにより、各低分子化合物に特異的に結合する非コードRNAの同定とその機能解析の進展も期待できる。今後、他の低分子リガンドを利用した化学プローブを作製して、それと特異的に相互作用するRNAの同定を目指す。
また、昨年度までに、preQ1リボスイッチの下流遺伝子の発現を抑制する第2世代の合成化合物を2種類特定していた。これに関しても、それらの学構造を基盤にしてさらに誘導体を合成する。得られた誘導体を用いて、in vitroにおける転写抑制活性を測定し評価する。また、合成した誘導体とpreQ1リボスイッチとの複合体の結晶を作製し、その結晶構造を決定して、化合物との結合様式を解明する。さらに、その立体構造情報をさらなる誘導体作製にフィードバックし、より効率的に転写活性を抑制する化合物を創製する方針である。

Causes of Carryover

新型コロナ感染症拡大のためリモート実験などが多くなり、当初予定していた旅費などの支出が無くなったため。また、おおむね研究は順調に進んでいるが、新型コロナ感染症の拡大のため実験がある程度制限され、消耗品などの支出が少なくなったことも原因である。
引き続き新型コロナ感染症対策のために実験が制限される可能性もあるが、次年度の助成金と合算して外注できる特殊な消耗品などに支出する予定であり、これにより研究の促進を図る。

Research Products

• [Int'l Joint Research] NCI/NIH(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: NCI/NIH
• [Journal Article] A chemical probe based on the PreQ1 metabolite enables transcriptome-wide mapping of binding sites (2021)
  • Author(s): Balaratnam, S., Rhodes, C., Bume, D.D., Connelly, C.M., Lai, C.C., Kelley, J.A., Yazdani, K., Homan, P.J., Incarnato, D., Numata, T. and Schneekloth, J.S. Jr.
  • Journal Title: Nat. Commun. Volume: 12 Pages: 5856
  • DOI: 10.1038/s41467-021-25973-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Family D DNA polymerase interacts with GINS to promote CMG-helicase in the archaeal replisome (2021)
  • Author(s): Oki, K., Nagata, M., Yamagami, T., Numata, T., Ishino, S., Oyama, T. and Ishino, Y.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: gkab799 Pages: gkab799
  • DOI: 10.1093/nar/gkab799
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] DNA polymerase D temporarily connects primase to the CMG-like helicase before interacting with proliferating cell nuclear antigen (2021)
  • Author(s): Oki, K., Yamagami, T., Nagata, M., Mayanagi, K., Shirai, T., Adachi, N., Numata, T., Ishino, S. and Ishino, Y.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 49 Pages: 4599-4612
  • DOI: 10.1093/nar/gkab243
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Minimal protein-only RNase P structure reveals insights into tRNA precursor recognition and catalysis (2021)
  • Author(s): Teramoto, T., Koyasu, T., Adachi, N., Kawasaki, M., Moriya, T., Numata, T., Senda, T. and Kakuta, Y.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 297 Pages: 101028
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2021.101028
  • Peer Reviewed