Characterization of sleep in brainless jellyfish, Cladonema radiatum

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K21421
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 立花 和則 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (60212031)
• Project Period (FY): 2020-07-30 – 2023-03-31
• Keywords: 末梢睡眠 / クラゲ / 散在神経系 / 行動解析 / ゲノム

Outline of Annual Research Achievements

睡眠は健康な生活に必須である。睡眠が不足すると、意識がもうろうとすることなどから、脳の休息に重要であると考えられるが、睡眠がどのように脳の機能回復に働くのかということの分子的実体は不明の点が多い。脳（中枢神経）の無いクラゲにも睡眠が存在することは、睡眠は、脳のみでなく、末梢においても何らかの役割を果たしていることを示している。私たちはクラゲの睡眠を「末梢睡眠」と名付け、本研究はこの末梢睡眠を明らかにすることを目的とする。クラゲの末梢睡眠は哺乳類などの睡眠とどう関係しているのだろうか？表面的な類似した現象にすぎないのか、それとも多くの動物の睡眠に共通の分子基盤が存在するのか？最近、エダアシクラゲのゲノム解析により、クラゲのゲノム中に、マウスで「眠気」を制御する鍵となる重要な遺伝子SIK3のオーソログが見つかった。このことはクラゲの末梢睡眠は哺乳類の睡眠に共通の分子基盤が存在することを示唆している。そこで、（１）クラゲの末梢睡眠は行動的にどれほど哺乳類の睡眠に共通しているかを調べる。次に（２）クラゲの末梢睡眠において、マウスで睡眠と覚醒の制御に重要なタンパク質であるSIK3分子の動態を解明する。今年度は、（１）の行動学的な解析のための実験系の整備、睡眠を阻害する刺激の条件の検討やクラゲの行動を記録する画像取得とその解析のソフトウエアの開発など進めた。（２）については、睡眠と覚醒の制御のカギとなる重要な分子であるSIK3タンパク質に対する抗体を作成しこれを用いた実験を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

クラゲの末梢睡眠は行動的にどれほど哺乳類の睡眠に共通しているかを調べる。これに関しては、睡眠の行動的な性質として、以下の3つあげられる。①休止状態と活動状態の周期的な交代、②休止状態での刺激に対する反応性の低下、③強制的に休止状態を阻害した後の休止期間の延長（これは徹夜などをした後の睡眠が長くなる、いわゆるリバウンドという現象）。今年度は、②に関して、クラゲの休止状態を解除するが、クラゲのその後の行動に悪影響を及ぼさない刺激を探している。振動モーターによる刺激、温度変化による刺激、光刺激などを調べ、刺激の強さ継続時間などの条件を検討している。現在、振動モーターによる刺激の条件が決まり、どのような刺激で、③のリバウンドがどのようになるかデータを収集しているところである。クラゲの末梢睡眠において、マウスで睡眠と覚醒の制御に重要なタンパク質であるSIK3分子の動態を解明する。SIK3はリン酸化により活性を調節されており、このリン酸化状態を検出することが必要である。そこでエダアシクラゲのSIK3の活性化したリン酸化状態（このリン酸化部位はクラゲからヒトに至るまで高度に保存された配列であり、プロテインキナーゼAによりリン酸化を受ける）を認識する抗体（1種類）と通常の抗体（2種類）を作成した。これらの抗体を用いて、エダアシクラゲの内在性のSIK3タンパク質を検出しようと試みているが、イムノブロットでは検出できずにおり、蛍光抗体法などの他の方法を検討している。

Strategy for Future Research Activity

クラゲの末梢睡眠は行動的にどれほど哺乳類の睡眠に共通しているかを調べる。クラゲの睡眠の行動学的解析においては、昨年度の実験系では一度に取れるデータが少ない（6匹のクラゲを同時に解析）という問題があったので、同時に24匹のデータの取れるように実験系を改良し、対応する画像解析のソフトウエアも改良した。その結果、より再現性の良い信頼できるデータが取得できるようになった。また、エダアシクラゲの睡眠様行動はクラゲの遺伝的系統、齢、摂食の状態、温度、光条件などにより影響を受けるため、これらの条件を検討し、最適条件を探している。また興味深いことにクラゲの系統により刺激に対する反応性が異なることがあきらかとなった。この反応性の違いと、睡眠の深さがどのような関係にあるのかを調べているところである。系統より睡眠の深さが異なることになると、睡眠の深さの遺伝的制御を明らかにできる可能性を示すものであり、現在、刺激に対する反応性の異なる系統を掛け合わせて調べているところである。クラゲの末梢睡眠において、マウスで睡眠と覚醒の制御に重要なタンパク質であるSIK3分子の動態を解明する。エダアシクラゲのSIK3タンパク質に対する抗体は、抗原ペプチドに関しては十分な力価を持っていることが分かった。また、抗リン酸化Sik3抗体は、期待通り活性化型（リン酸化型）を強く認識することが確認された。しかし、まだ内在性のSIK3タンパク質を検出できる条件を見いだせていない。現在、エダアシクラゲの抽出物を抗SIK3抗体で免疫沈降して、標的を濃縮することなどにより検出するため、免疫沈降の条件検討をしている。また、抗体での検出の試みと並行して、SIK3のin situ hybridizationにより、mRNAの局在を検出し、組織でのSIK3発現を調べるために、エダアシクラゲのin situ hybridizationの実験系を確立しようとしている。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた主な理由は、いろいろな睡眠の状態のエダアシクラゲについてRNAseqを予定していたが、これまでの実験の結果、エダアシクラゲの系統間で睡眠の性質に違いがあることや、齢、摂食の状態、温度、光条件などの睡眠への影響が大きいことが判明し、今年度は系統間の睡眠行動の違いを詳しく調べて、さらに齢や温度などのいろいろな条件を比較し、そののちに必要なRNAseqを来年度に行うことにしたことである。これは拙速にRNAseqを行ってしまうと、重要な睡眠の状態のデータを取得しそこなう可能性があるからである。そのため、来年度に今年度使用予定だったRNAseqの助成金を使用する計画に修正した。