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2020 Fiscal Year Research-status Report

MRSAを特異標的とするCRISPR-Cas型抗菌薬の開発研究

Research Project

Project/Area Number 20K21671
Research InstitutionNiigata University

Principal Investigator

寺尾 豊  新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 伊東 孝祐  新潟大学, 自然科学系, 准教授 (20502397)
土門 久哲  新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00594350)
前川 知樹  新潟大学, 医歯学系, 研究教授 (50625168)
Project Period (FY) 2020-07-30 – 2022-03-31
KeywordsMRSA
Outline of Annual Research Achievements

2019年末からの新型コロナウイルス(SRAS-CoV-2)パンデミックで,飛沫感染する病原体による肺炎で治療薬(病原体の除去薬)がないことの懸念が周知された.ウイルスと同様に病原体の除去が困難な感染症課題として,米国で「薬剤耐性MRSA等の対策」,日本で「薬剤耐性アクションプラン」,そしてサミットと国連総会で「MRSA等の耐性菌対策」が提示され続けている.背景にあるのは,耐性菌の増加に伴い,治療困難となった感染者の死亡数が増加している現状である.一方で,国内外の医歯薬学領域では,腫瘍や再生等の分野に研究資源が集中し,耐性菌に対する新薬開発が停滞している.2019年10月時点で,本申請者が国内外の新規抗菌薬開発の特許出願ならびに論文検索を実施したところ,同開発は17のグループで進められていることが明らかとなった.しかし,それらは全てβラクタマーゼを阻害する着想であり,MRSAの耐性進化を予見すると心許ない.
そこで本研究では,CRISPR-Cas発現のプラスミドDNAを素材とすることで ① 副反応の可能性が低く,② 耐性進化に合わせ ガイドRNA配列を変更するだけで薬剤標的を変更できる簡便さに富み,③ 安価で安定な,MRSA用の新抗菌薬の開発に挑戦することとし,研究を推進している.さらに,以前に基盤B海外で採択され研究した疫学データを活用し,将来の発生が懸念される新たな耐性機構を持つMRSAまでをin vitro およびin silicoで推測し,それらに対するCRISPR-Cas型の新規抗菌薬を予測開発するAIアルゴリズムを確立することも目標とし研究を進めている.その結果として,申請2ヵ年計画の半年間で,本課題のキーとなる各種ツールを準備した.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は,2ヵ年で計画する.研究初年度は,高齢者の肺炎/誤嚥性肺炎の主たる起因菌であるMRSAを対象菌に選び,かつMRSAの主要なペニシリン耐性因子PBP2’に標的を絞る.PBP2’に相補なガイドRNA配列を含むCRISPR-Casプラスミドを作製し,in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し,CRISPR-Cas型抗菌薬の構築サイクルを確立させることとしていた.現在までに,以下のステップを実施し,かつ中間報告の一部を英語論文にて発表も行っている.そのため,おおむね順調な進展と自己評価した.次に,具体的な実施ステップを記す.
1. 耐性因子PBP2’のDNA配列から,Cas酵素が結合できるPAM配列(5’-NGG)を全て選出し,その上流から約20塩基の配列をそれぞれガイドRNA候補とする.その後,ゲノム編集の成功率を高めるため,フリーウエアの“CRISPRdirect”および“CHOPCHOP”にて,最終的な塩基長を二重検証し確定する.次いで,3’末端側にPAM配列(-NGG)を付加したうえで,人工合成する“PAM+ガイドRNA配列”を決定する.2. 合成したPAM+ガイドRNA配列が,MRSA内で標的のみを切断するかを in vitroの確認キット(Guide-it Complete sgRNA Kit,TaKaRa社)にてスクリーニングする.3. CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid(サンタクルズ社)等の専用プラスミドをメーカー別に複数購入し,上記手順にてin vitro検証したPAM+ガイドRNA配列を網羅的に組み込む.そして,PAM+ガイドRNA配列をCasタンパク質と共に同時発現するプラスミドを構築する.これらを“CRISPR-Cas型抗菌薬”候補とした.

Strategy for Future Research Activity

初年度の“CRISPR-Cas型抗菌薬”候補をMRSA感染マウスに投与し,生存率を観察する.併せてマウス血液を採取し,血中の残存MRSA数をコロニー培養法で計測する.同時に,抗DNA抗体価はELISA解析し,サイトカインの増減はLuminex装置で多検体同時解析する.マウス血液中の投与DNA残留については,プラスミド中のM13シークエンスタグを利用してPCR検出する.次に,MRSA生育に必須なGAPDH等に結合するDNA配列を選出する.その際には,ヒトおよび常在細菌の同名タンパク質へ副反応を起こさないよう,生物種別のタンパク立体構造解析を行う.そして,MRSAに特異的なドメインの配列を選出する.初年度の手技に従い,CRISPR-Cas型抗菌薬の効果判定を行い,データをPCに蓄積する.In vitroのMIC試験を繰り返し,やがて耐性が生じるCRISPR-Cas型抗菌薬のガイドRNA配列を検索する.次いで,ビッグデータセンターのGeForce並列計算システムで,薬剤耐性因子の進化パターンをディープラーニングさせる.MRSAの耐性変遷は,申請者である寺尾が2017年度までに遂行した基盤Bデータから転送し,新規耐性菌の出現時期の予測を試みる.そして,予測される耐性菌にも奏効するCRISPR-Cas型抗菌薬をビッグデータ解析から推測する.
また,2年目のバックアッププランとしては,以下を準備している.すなわち,標的の耐性タンパク質の立体構造をPDBjソフトにて予測し,ガイドRNA配列とのPCドッキングシミュレーションから,特異的な結合予測をマニュアル作業で実施する.
なお,これら一連の手技に関しては,文部科学省事業「科学技術イノベーション創出に向けた大学フェローシップ創設事業」のフェローシップ大学院生にも教示しながら推進する.

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの世界的大流行により,一部消耗品(物品費)の流通に影響が生じたことは周知の事実である.その物流停滞の影響を受け,2387円分の支出が年度内には完遂できなかった.

  • Research Products

    (29 results)

All 2021 2020

All Journal Article (15 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 15 results) Presentation (9 results) (of which Invited: 1 results) Book (5 results)

  • [Journal Article] Effects of erythromycin on osteoclasts and bone resorption via DEL-1 induction in mice.2021

    • Author(s)
      Tamura H, Maekawa T, Domon H, Hiyoshi T, Hirayama S, Isono T, Sasagawa K, Yonezawa D, Takahashi N, Oda M, Maeda T, Tabeta K, Terao Y
    • Journal Title

      Antibiotics

      Volume: 10 Pages: 312

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The role of neutrophils and neutrophil elastase in pneumococcal pneumonia.2021

    • Author(s)
      Domon H, Terao Y
    • Journal Title

      Front Cell Infect Microbiol.

      Volume: 11 Pages: 615959

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Proteolytic cleavage of HLA class II by human neutrophil elastase in pneumococcal pneumonia.2021

    • Author(s)
      Domon H, Maekawa T, Isono T, Furuta K, Kaito C, Terao Y
    • Journal Title

      Sci Rep

      Volume: 11 Pages: 2432

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Rice peptide with amino acid substitution inhibits biofilm formation by Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum.2021

    • Author(s)
      Matsugishi A, Aoki-Nonaka Y, Yokoji-Takeuchi M, Yamada-Hara M, Mikami M, Hayatsu M, Terao Y, Domon H, Taniguchi M, Takahashi N, Yamazaki K, Tabeta K
    • Journal Title

      Arch Oral Biol

      Volume: 121(1) Pages: 104956

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The proinflammatory cytokine IL-36γ is a global discriminator of harmless microbes and invasive pathogens within epithelial tissues.2020

    • Author(s)
      Macleod T, Ainscough JS, Hesse C, Konzok S, Braun A, Buhl A, Wenzel J, Bowyer P, Terao Y, Herrick S, Wittmann M, Stacey M
    • Journal Title

      Cell Rep

      Volume: 33(11) Pages: 108515

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Treatment of severe pneumonia by hinokitiol in a murine antibiotic-resistant pneumococcal pneumonia model.2020

    • Author(s)
      Isono T, Domon H, Nagai K, Maekawa T, Tamura H, Hiyoshi T, Yanagihara K, Kunitomo E, Takenaka S, Noiri Y, Terao Y
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 15(10) Pages: 240329

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Erythromycin inhibits neutrophilic inflammation and mucosal disease by upregulating DEL-1.2020

    • Author(s)
      Maekawa T, Tamura H, Domon H, Hiyoshi T, Isono T, Yonezawa D, Hayashi N, Takahashi N, Tabeta K, Maeda T, Oda M, Ziogas A, Alexaki VI, Chavakis T, Terao Y, Hajishengallis G
    • Journal Title

      JCI Insight

      Volume: 5(15) Pages: 136706

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Sulfated vizantin inhibits biofilm maturation by Streptococcus mutans.2020

    • Author(s)
      Oda M, Kurosawa M, Yamamoto H, Domon H, Takenaka S, Osumi T, Maekawa T, Yamasaki N, Terao Y
    • Journal Title

      Microbiol Immunol

      Volume: 64(7) Pages: 493-501

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Innate immune responses in serum and cerebrospinal fluid from neonates and infants infected with parechovirus-A3 or enteroviruses.2020

    • Author(s)
      Habuka R, Aizawa Y, Izumita R, Domon H, Terao Y, Takihara H, Okuda S, Saitoh A
    • Journal Title

      J Infect Dis

      Volume: 222(4) Pages: 681-689

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Effects of sub-minimum inhibitory concentration of chlorhexidine gluconate on development of in vitro multi-species biofilms. Biofouling.2020

    • Author(s)
      Suzuki Y, Ohsumi T, Isono T, Nagata R, Hasegawa T, Takenaka S, Terao Y, Noiri Y
    • Journal Title

      Biofouling

      Volume: 336(2) Pages: 146-158

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Animal model of periodontitis ― Analysis of experimental ligature-induced periodontitis model in mice ―.2020

    • Author(s)
      Tamura H, Maekawa T, Hiyoshi T, Terao Y:
    • Journal Title

      Methods Mol Biol

      Volume: 2210 Pages: 237-250

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Protective effect of hinokitiol against periodontal bone loss in ligature induced experimental periodontitis in mice.2020

    • Author(s)
      Hiyoshi T, Domon H, Maekawa T, Yonezawa D, Kunitomo E, Tabeta K, Terao Y
    • Journal Title

      Arch Oral Biol

      Volume: 112(4) Pages: 104679

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Effect of a novel glass ionomer cement containing flour-zinc-silicate fillers on biofilm formation and dentin ion incorporation.2020

    • Author(s)
      Hasegawa T, Takenaka S, Ohsumi T, Ida T, Ohshima H, Terao Y, Traithawit N, Maeda T, Noiri Y
    • Journal Title

      Clin Oral Investig

      Volume: 24(2) Pages: 963-970

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Antibacterial activity of hinokitiol against both antibiotic-resistant and -susceptible pathogenic bacteria predominant in the oral cavity and upper airways.2020

    • Author(s)
      Domon H, Hiyoshi T, Maekawa T, Yonezawa D, Tamura H, Kawabata S, Yanagihara K, Kimura O, Kunitomo E, Terao Y
    • Journal Title

      Microbiol Immunol

      Volume: 63 Pages: 213-222

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Adjunct use of mouth rinses with a sonic toothbrush accelerates the detachment of a Streptococcus mutans biofilm: an in vitro study.2020

    • Author(s)
      Ohsumi T, Takenaka S, Sakaue Y, Suzuki Y, Nagata R, Hasegawa T, Ohshima H, Terao Y, Noiri Y
    • Journal Title

      BMC Oral Health

      Volume: 20 Pages: 161

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 肺炎球菌性肺炎モデルマウスにおけるヒノキチオール気管内投与の治療効果.2021

    • Author(s)
      磯野俊仁,土門久哲,前川知樹,田村 光,日吉 巧,柳原克紀,國友栄治,寺尾 豊
    • Organizer
      第94回日本細菌学会総会
  • [Presentation] 抹茶を用いた肺炎の予防・治療研究.2021

    • Author(s)
      寺尾 豊,笹川花梨,坂上莉奈,磯野俊仁,土門久哲
    • Organizer
      抹茶と健康研究会
    • Invited
  • [Presentation] 中球エラスターゼによる歯周病重症化メカニズム解析と新規治療法への応用.2020

    • Author(s)
      日吉 巧,土門久哲,前川知樹,田村 光,米澤大輔,多部田 康一,寺尾 豊
    • Organizer
      令和2年度新潟歯学会第2回例会
  • [Presentation] Erythromycin regulates bone metabolism through induction of Del-1.2020

    • Author(s)
      Tamura H, Maekawa T, Domon H, Hiyoshi T, Isono T, Yonezawa D, Maeda T, Terao Y, Tabeta K
    • Organizer
      第63回秋季日本歯周病学会学術大会
  • [Presentation] 好中球エラスターゼによる歯周炎重症化メカニズム解析.2020

    • Author(s)
      日吉 巧,土門久哲,前川知樹,田村 光,磯野俊仁,寺尾 豊,多部田康一
    • Organizer
      第63回秋季日本歯周病学会学術大会
  • [Presentation] エリスロマイシンによるDel-1誘導を介した骨代謝の制御.2020

    • Author(s)
      田村 光,前川知樹,土門久哲,日吉 巧,前田健康,寺尾 豊
    • Organizer
      第62回歯科基礎医学会学術大会
  • [Presentation] ヒノキチオールの抗菌活性および抗炎症作用によるマウス歯牙結紮歯周炎モデル骨吸収抑制作用の解析.2020

    • Author(s)
      日吉 巧,土門久哲,前川知樹,田村 光,國友栄治,寺尾 豊
    • Organizer
      第62回歯科基礎医学会学術大会
  • [Presentation] 宿主由来エラスターゼはHLAクラスII発現を抑制する.2020

    • Author(s)
      土門久哲,前川知樹,寺尾 豊
    • Organizer
      第62回歯科基礎医学会学術大会
  • [Presentation] マウス歯牙結紮歯周炎モデルにおけるヒノキチオールの骨吸収抑制作用の解析.2020

    • Author(s)
      日吉 巧,土門久哲,前川知樹,田村 光,米澤大輔,國友栄治,寺尾 豊,多部田康一
    • Organizer
      第63回春季歯周病学会学術大会
  • [Book] 微生物学.歯科衛生士書き込み式学習ノート?@ 専門基礎科目編 人体の構造と機能/歯・口腔の構造と機能/疾病の成り立ち及び回復過程の促進 第2版 改訂第3刷2021

    • Author(s)
      寺尾 豊(分担執筆)
    • Total Pages
      302
    • Publisher
      医歯薬出版
  • [Book] 口腔微生物学・免疫学 第4版 改訂第6刷2020

    • Author(s)
      寺尾 豊(分担執筆)
    • Total Pages
      303
    • Publisher
      医歯薬出版
  • [Book] パーフェクトマスター 口腔微生物学・免疫学 改訂第2刷2020

    • Author(s)
      寺尾 豊
    • Total Pages
      93
    • Publisher
      医歯薬出版
  • [Book] Aroma Research:ヒノキチオールの肺炎および歯周病に対する効果2020

    • Author(s)
      寺尾 豊
    • Total Pages
      70
    • Publisher
      Fragrance Journal
  • [Book] 和香通信:薬剤耐性(AMR)肺炎球菌による肺炎に対するヒノキチオールの治療効果2020

    • Author(s)
      寺尾 豊
    • Total Pages
      30
    • Publisher
      日本産天然精油連絡協議会

URL: 

Published: 2021-12-27  

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