マラリア原虫スポロゾイト肝細胞侵入関連分子に対する肝細胞側レセプター分子の同定

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21390124
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 鳥居 本美 Ehime University, 大学院・医学系研究科, 教授 (20164072)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石野 智子 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 准教授 (40402680) ; 大槻 均 鳥取大学, 医学部, 講師 (80403806)
• Keywords: 原虫 / マラリア / 侵入

Research Abstract

マラリア原虫のヒトへの侵入型であるスポロゾイトは、血流に乗って肝臓に至り、肝細胞内に寄生胞を形成して侵入し、肝細胞期の発育を開始する。スポロゾイトの先端部小器官の一つであるマイクロネームに局在する分子がスポロゾイトの肝細胞侵入に重要な役割を果たすことが、ノックアウト原虫を用いた研究によって明らかにされている。しかし、これらの分子の肝細胞侵入における機能解析は全く進んでいない。本研究は、上記の肝細胞侵入関連スポロゾイト側タンパク質としてすでに同定されているP36p分子が結合する肝細胞表面のレセプター分子を同定することを目的として以下の研究を実施した。
まず薬剤選択カセットなく蛍光タンパク質(GFPまたはRFP)を発現するネズミマラリア原虫(P. yoeliiまたはP. berghei)のスポロゾイトを感染蚊の唾液腺から回収を行った。これを肝由来培養細胞(HepG2)に添加し、1時間後の培養肝細胞を材料にFACS法により感染細胞数を解析することで、最適な感染条件の検討を行った。また、P36pに対する単クローン抗体を培養液に添加した場合の寄生に対する阻害効果を検討した。次いでFar western法によってP36pに対する肝細胞側の結合分子の探索を行った。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法を用いてP. yoeliiのP36pタンパク質の全長を発現させた。HepG2細胞の膜画分、細胞質画分をそれぞれSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写したものに組換えP36pを反応させた後に、単クローン抗体を用いて組換えP36pに結合させることによって、複数のHepG2由来の結合候補分子の絞り込みを行った。また、マウス肝細胞のプロテオーム解析データを利用して、肝細胞で発現する遺伝子の検索を行った。