2009 Fiscal Year Annual Research Report
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21510124
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
竹内 裕子 Osaka University, 大学院・生命機能研究科, 特任助教 (00437401)
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| Keywords | BKチャネル / 構造機能連関 / 光学的・電気的同時計測 / 新規開口薬開発 / 脂質平面膜 / 一分子計測 |
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| Research Abstract |
[BKチャネルの合成と蛍光標識]
昆虫細胞の抽出液を用いて非細胞系でのBKチャネルタンパクの発現を試みた。現在まで真核生物のチャネルを無細胞タンパク合成系で作成した報告はほとんどないが、この方法が確立されれば非天然型アミノ酸の導入も容易であり特定の部位を標識でき、BKチャネルの構造と機能連関を詳細に調べることが可能になる。BKチャネルの発現は、C末に挿入したstrep-tag抗体によるwesternやラベルした非天然型アミノ酸の蛍光等で確認した。しかし発現が確認できたものは、短いものが多く、全長のものが少なかった。これを解決するため、BKチャネルのN末にNaチャネルのsiginal sequenceを挿入し、全長BKチャネルの発現を確認できた。現在、それらのチャネル活性を測定中である。
[KvAPチャネルの一分子イメージング]
BKチャネル一分子の電気的・光学的同時計測のための基本的な装置はすでに出来ているが、本研究では、より安定した効率の良い計測装置の開発を行うことも目的としていた。チャネルタンパクの不動化と再構築の効率化をはかるため、His-tagを介してコバルトビーズに付いたままのチャネルを人工脂質膜に再構成することを試みた。そのための材料として電位依存性チャネルの中で最も構造が単純で結晶構造も調べられているKvAPチャネルを用いた。C末にHis-tagが付加されたシステイン変異体を作成、蛍光標識し、電位変化に伴う活性変化と蛍光変化を調べた。現在、コバルトビーズに付いたままのチャネルの再構成を試みている段階である。
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