2009 Fiscal Year Annual Research Report
核磁気共鳴の緩和分散法を利用した酵素活性部位の遷移状態の構造解析
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21570170
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
池上 貴久 Osaka University, 蛋白質研究所, 准教授 (20283939)
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| Keywords | 核磁気共鳴 / NMR / 遷移状態 / induced-fit / 構造解析 / CPMG / 緩和分散 / 残余双極子相互作用 |
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| Research Abstract |
NMRの緩和分散法を用いた蛋白質の遷移状態に関する研究は、この数年で世界のいくつかのグループで試され、非常に有用であると認められつつある。しかし、この緩和分散法から得られた遷移状態での化学シフト値や残余双極子相互作用値から、その状態での立体構造を決定した例はない。当研究では核磁気共鳴を用いて、数%程度しか存在しない遷移(励起)状態での酵素の構造を決定する。その構造が実際に基質のはまり込んだ状態と同じであるかどうかを比較し、酵素の基質認識のメカニズムを考察する。具体的には、土壌細菌が分泌するキチン分解酵素の活性部位に適用する。同時に、この分野は可能性が示されただけで、まだ応用例は一つも出ていないので、そのためのNMR方法論を確立する。各種の等方性化学シフト値、異方性化学シフト値、残余双極子相互作用値をNMRの緩和分散法で取得し、それを総合的に構造計算に利用する。これにより、キチナーゼの遷移状態での構造を決定する。
キチナーゼのキチン分解活性ドメイン(放線菌Streptomyces griseus由来ChiC)を遺伝子組み換え大腸菌を用いて安定同位体^<15>N/^<13>Cで標識した状態で発現させた。NMRにより主鎖により帰属を完成させた。また、Pf1-ファージを使って当蛋白質を静磁場中で配向させ、残余双極子相互作用値を測定した。この残余双極子相互作用値は、ドメインの立体構造から逆算された値とよく一致し、Pf1-ファージを使った系が今後の実験にとって有効であることが実証された。さらに、CPMGパルス系列のプログラムを改良し、データのフィッティングのための計算環境を構築した。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Arabidopsis Tic62 and ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase form light-regulated complexes that are integrated into the chloroplast redox poise2009
Author(s)
Benz, J.P., Stengel, A., Lintala, M., Lee, Y.H., Weber, A., Philippar, K., Gugel, I.L., Kaieda, S., Ikegami, T., Mulo, P., Soll.J., Bolter.B
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Journal Title
Plant Cell 21
Pages: 3965-3983
Peer Reviewed
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[Journal Article] Unusual thermal disassembly of the SPFH domain oligomer from Pyrococcus horikoshii2009
Author(s)
Kuwahara, Y., Unzai, Nagata, T., Hiroaki, Y., Yokoyama, H., Matsui, I., Ikegami, T., Fujiyoshi, Y., Hiroaki, H.
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Journal Title
Biophysical Journal 97
Pages: 2034-2043
Peer Reviewed
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