ノックダウンを用いた軽度低温の脳浮腫抑制効果に果たす水チャンネルの機能解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21591982
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 藤田 義人 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (90238593)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70212462) ; 祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90264738)
• Keywords: 水チャンネル / 脳浮腫 / ノックダウン / アクアポリン / 脳低温 / RNAi

Research Abstract

今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP)Knockdown細胞株の確立を重点に行った。
Knockdownが確認されているconstructを作成したうえ、vectorに導入した。アストロサイトにtransfectionする方法として、リポフェクションを利用した、Trans-IT Neuralを使用した。ただ、transfectionをおこないRNAiのの効率が非常に悪く、10%以下となっている。このことに関して、transfection効率の最もよくなると考えられる条件を、mediumの組成や、transfection reagentの量、vectorの量などの最適条件を検討中した。ウエスタンでRNAiの効果を確認するが効果が弱く、原因が(1)transfectionの効率が悪い(2)実際のRNAiがうまくいっていないかはっきりわからなかった。そこで、その原因追求のため、transfection効率を視覚的に確認するためvecterにGFPをつけることを試みた。GFPをvectorに挿入した。そしてGFPをつけたvectorを大量制作した。
そのGFPつきのvectorの挿入で、視覚的におおざっぱにいって20%ぐらいのtransfection効率があることを確認した。ただRNAi効果をえる効率は、まだ10%程度にとどまった。試行錯誤の結果、現段階ではこれ以上効率をあげることは難しいと考えられた。その解決策として、transfection効率をあげるためレンチウイルスを使用したvectorの作製を進めることを検討中である。また、現在作成してあるGFPつきvectorで、実際の低温における脳浮腫効果の解明を始めている。さらに、AQP4を発現する適当なcell lineを探し、現在作成されているconstructの入ったvectorを使用して、AQP4をkockdownできているcell lineの確立を試みている。Cell lineが確立できれば低温などの条件を付加して、低酸素に対する予防を行う予定である。