試験管内再現系を用いた、クロマチンの構造制御/転写活性制御の解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21770167
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 日詰 光治 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助教 (10378846)
• Keywords: クロマチン / 原子力間顕微鏡 / 試験管内再構成

Research Abstract

出芽酵母を材料として、クロマチン構造と複製制御、更には、転写活性の異なる領域間における複製開始制御の相違について調査するため、出芽酵母クロマチンの再構成系とその原子間力顕微鏡(AFM)観察手法を確立した。まず、大腸菌で発現させた酵母コアヒストンのサブユニットから、コアヒストンオクタマーを形成させ、精製・単離した。それを用いて、ヌクレオソームファイバーを形成させ、原子間力顕微鏡により観察することに成功した。また、複製開始点(ARS)配列を含むDNAと、複製開始点を決定するORC複合体の相互作用をAFM観察により解析した。その結果、ARS配列非依存的にDNA上にORC複合体が結合している様子が観察された。現在、ORCと再構成ヌクレオソームファイバーとの相互作用の可視化解析に挑戦している。更に、酵母細胞内から、ヒストンやORC複合体、MCM複合体などのタンパク質と相互作用したままの状態のプラスミドを精製し、AFM観察に供した。細胞周期が、非同調およびG1期同調の酵母細胞内から1.8kbのプラスミドを精製し、Pre-RCと思われる複合体(ヌクレオソームよりも明らかにサイズの大きな構造体)がDNA上に相互作用している様子が観察された。ヌクレオソーム構造に加え、ORCやMCM等の複合体が相互作用したクロマチンファイバーを解析する上で、AFMにより観察されたDNA上の"物体"がどのタンパク質であるかを特定することは、困難であるが重要な課題である。これを解決する手段として、AFMの探針の先端に特定のタンパク質を認識する抗体を接着して、これを用いてAFM観察を行ない、特異的タンパク質のAFM像内での位置を特定する手法が挙げられる。その技術の確立を目指し、Actinin-4タンパク質を、抗Actinin-4抗体により修飾したAFM探針により観察し、AFM画像内でのその位置を特定することに成功した。