2011 Fiscal Year Annual Research Report
歯胚特異的転写因子Sp6の活性―構造相関の解明と相互作用分子の同定
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21791805
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
三好 圭子 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 講師 (20304537)
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| Keywords | 転写因子 / SP6 / 標的配列 / 活性-構造相関 / 相互作用分子 |
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| Research Abstract |
前年度の研究成果から、転写因子SP6は半減期が短く、SP6タンパク質の安定性により歯の発生分化における転写制御を行っている可能性が示唆された。
そこで、まずSP6の転写因子としての機能に影響を及ぼす領域の同定を行った。平成21年度に作製したGC-box,GT-boxを挿入したレポーターベグターと平成22年度に作製した種々の長さのSP6発現ベクターを歯原性上皮細胞G5に導入し、レポーターアッセイにより転写活性化能に及ぼすSP6タンパク質の構造の影響を解析した。その結果、SP6全長タンパク質を用いた実験ではGC-box,GT-boxのいずれもコントロールベクター単独でレポーター活性が高く、SP6タンパク質の本来の活性を評価するのが困難であることが判明した。そこで、SP6標的遺伝子の一つである、フォリスタチン(Fst)およびアメロチン(Amtn)の各プロモーターを連結したレポーターを用いて同様の解析を行った。陽性コントロールとしてはSP1発現ベクターを構築し、使用した。その結果、SP1ではFstプロモーターで約10倍、Amtnプロモーターで約1.8倍の活性があり、全長SP6ではそれぞれ約3倍ほどの転写活性を検出した。さらに3つのジンクフィンガードメインのうち1つまたはすべて欠損させてもAmtnレポーター活性に影響をほとんど与えなかったが、Fstプロモーターでは1つ欠損することでレポーター活性が強度に低下し、すべて欠損させると中程度に活性が低下した(未発表データ)。
以上のことから、(1)SP6の標的DNA結合配列は一般的なGC-,GT-boxではない(2)相互作用する分子の存在、の2つの可能性が示唆された。現在、免疫沈降法によりSP6が直接結合しているDNAまたはタンパク質を回収し同定するためのサンプル調整を行っているが、現時点では回収量が不十分なため、方法を改良中である。
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