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2021 Fiscal Year Annual Research Report

Large-scale proteoform analysis for unveiling the entire view

Research Project

Project/Area Number 21H02459
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

石濱 泰  京都大学, 薬学研究科, 教授 (30439244)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
Keywordsプロテオフォーム / プロテオーム / スプライシング / 翻訳開始点 / プロテオリシス
Outline of Annual Research Achievements

プロテオフォームとは、RNAスプライシングやSNPs等のmRNAに由来するアイソフォームだけではなく、翻訳制御により様々な翻訳開始点や終始点をもつタンパク質、翻訳後に生じる内在性プロテオリシス産物や翻訳後修飾体も含めて多様なタンパク質一次配列の違いに基づく呼称である。本研究では、①プロテオフォームを大規模解析する技術を開発し、②プロテオフォームがもたらすプロテオーム多様性が、どのような制御を受けて形成されているか、その全体像「プロテオフォームランドスケープ」を明らかにする。これらは、本研究の次のステージで、細胞の機能や疾病との関連を調べるための基盤となる。R3年度は、タンパク質N末端およびC末端ペプチド濃縮法の確立に注力した。その結果、消化酵素にTrypNを用い、従来のHPLC型のイオン交換クロマトグラフィーから使い捨てピペットチップ型のイオン交換クロマトグラフィーを用いる系で95%以上の選択性でタンパク質N末端由来ペプチドの単離に成功した。同様にして、タンパク質C末端ぺプチドに対しても、Glu-Cとピペットチップ型配位子交換クロマトグラフィーにより、タンパク質C末端由来ペプチドのみを濃縮できることが分かった。さらに、トリプシン消化とイオン交換クロマトグラフィーにより、N-アシル化タンパク質N末端由来ペプチドとタンパク質C末端ぺプチドの濃縮条件を最適化した。これらの単離法はいずれも消化とクロマトグラフィーによる分画という2ステップのみで構成され、95%以上の高い濃縮率の実現に成功した。これらの手法を脂肪細胞分化やポリペプチド新生鎖に適用し、プロテオフォーム特異的な制御機構同定の検討を開始した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、一年目に主要な手法の確立に成功した。一部の手法については更なる最適化が必要であるが、全体の進捗に影響を及ぼすほどではなく、順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

がん細胞株群を用いた細胞株選択的プロテオフォーム制御機構解明
代表者が研究代表者を務めるプロテオームデータリポジトリjPOSTは、JSTライフサイエンスデータベースプロジェクトで、ヒトゲノム/遺伝子, 遺伝的多様性, エピジェネティクス, RNA情報を集積したデータベースであるDBKERO (http://kero.hgc.jp)と連携している。DBKEROにはヒト非小細胞肺がん細胞株26種について徹底的に測定したRNAデータがコアデータとして格納されている(選択的スプライシングデータ、ゲノム変異データなどを含む)。この研究チームと連携し、同一条件の試料を調製した後、非小細胞肺がん細胞株26種についてプロテオーム規模でプロテオフォームデータを取得する。N, C末端プロテオームデータ、分子量分画プロテオーム解析データ、培養上清も含めた細胞内小器官別プロテオーム解析データ、パルスラベルSILAC法を用いてタンパク質合成・分解を区別したプロテオームデータなどを取得する。得られたデータについて、トランスクリプトーム―プロテオーム相関解析に加え、プロテオフォームやさらにその構成因子との相関について解析をおこなう。
さらに、異なる組織由来の10種のがん細胞株のectodomain shedding研究において、我々はすでに、培養上清の末端プロテオミクスにより、内在性プロテオリシス産物としてN末端5,952種、C末端5,848種を同定することに成功している(bioRxiv 2020.09.23.310102; doi: 10.1101/2020.09.23.310102)。この試料についても、大規模プロテオフォーム解析を行う。

  • Research Products

    (22 results)

All 2022 2021

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 4 results) Presentation (15 results) (of which Int'l Joint Research: 8 results,  Invited: 9 results)

  • [Journal Article] Motif-centric phosphoproteomics to target kinase-mediated signaling pathways2022

    • Author(s)
      Chia-Feng Tsai, Kosuke Ogata, Naoyuki Sugiyama, Yasushi Ishihama
    • Journal Title

      Cell Reports Methods

      Volume: 2 Pages: 100138

    • DOI

      10.1016/j.crmeth.2021.100138

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] One-step Isolation of Protein C-terminal Peptides from V8 Protease-digested Proteins by Metal Oxide-based Ligand Exchange Chromatography2022

    • Author(s)
      Hiroshi Nishida, Yasushi Ishihama
    • Journal Title

      Anal Chem

      Volume: 94 Pages: 944-951

    • DOI

      10.1021/acs.analchem.1c03722

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of Endogenous Kinase Substrates by Proximity Labeling Combined with Kinase Perturbation and Phosphorylation Motifs.2021

    • Author(s)
      Niinae T, Imami K, Sugiyama N, Ishihama Y.
    • Journal Title

      Mol Cell Proteomics

      Volume: 20 Pages: 100119

    • DOI

      10.1016/j.mcpro.2021.100119

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Nano-scale solid-phase isobaric labeling for multiplexed quantitative phosphoproteomics2021

    • Author(s)
      Ogata K, Tsai CF, Ishihama Y.
    • Journal Title

      J Proteome Res

      Volume: 20 Pages: 4193-4202

    • DOI

      10.1021/acs.jproteome.1c00444.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] CoolTip: Low-Temperature Solid-Phase Extraction Microcolumn for Capturing Hydrophilic Peptides and Phosphopeptides2021

    • Author(s)
      Kosuke Ogata, Yasushi Ishihama
    • Journal Title

      Mol Cell Proteomics

      Volume: 20 Pages: 100170

    • DOI

      10.1016/j.mcpro.2021.100170

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Peptide probes containing a non-hydrolyzable phosphotyrosine-mimetic residue for enrichment of protein tyrosine phosphatases2021

    • Author(s)
      Tsumagari K, Niinae T, Otaka A, Ishihama Y.
    • Journal Title

      Proteomics

      Volume: - Pages: e2100144

    • DOI

      10.1002/pmic.202100144

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A simple protocol for analyzing the protein terminome of culture supernatants of human cancer cell lines2021

    • Author(s)
      K Tsumagari, CH Chang, Y Ishihama
    • Journal Title

      Star Protocols

      Volume: 2 Pages: 100682

    • DOI

      10.1016/j.xpro.2021.

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 新生ポリペプチド鎖N末端アセチル化修飾の大規模解析法の開発2022

    • Author(s)
      森川和哉、内山純貴、西田紘士、今見考志、石濱泰
    • Organizer
      日本薬学会第142年会
  • [Presentation] 新生ポリペプチド鎖N末端アセチル化修飾の大規模解析法の開発2022

    • Author(s)
      森川和哉、内山純貴、西田紘士、今見考志、石濱泰
    • Organizer
      第3回生体分子分析ワークショップ
  • [Presentation] Peak Identification and Quantification by Proteomic Mass Spectrogram Decomposition2021

    • Author(s)
      Yasushi Ishihama
    • Organizer
      10th Asia-Oceania Human Proteome Organization Congress
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Isolation of Protein C-terminal Peptides by V8 Protease Digestion Coupled with Ligand Exchange Chromatographic Separation2021

    • Author(s)
      Hiroshi Nishida, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      10th Asia-Oceania Human Proteome Organization Congress
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 薬学プロテオミクスの最前線2021

    • Author(s)
      石濱泰
    • Organizer
      第47回BMSコンファレンス(BMS2020/2021)
    • Invited
  • [Presentation] Novel one-step isolation method for protein C-terminal peptides with ligand exchange chromatography2021

    • Author(s)
      Hiroshi Nishida, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      PBA2021 31st International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Protein Terminomics to Uncover Human Proteoform Atlas2021

    • Author(s)
      Yasushi Ishihama
    • Organizer
      PBA2021 31st International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 配位子交換クロマトグラフィーによるワンステップタンパク質C末端ペプチド濃縮法の開発2021

    • Author(s)
      西田 紘士、石濱 泰
    • Organizer
      BMAS2021 第33回バイオメディカル分析科学シンポジウム
  • [Presentation] プロテオーム解析のための基盤技術開発と応用2021

    • Author(s)
      石濱泰
    • Organizer
      日本分析化学会第70年会
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] タンパク質プロテオフォームの大規模解析2021

    • Author(s)
      石濱泰
    • Organizer
      第71回日本薬学会関西支部総会・大会
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Large-Scale Identification of Protein N- and C-Termini to Profile Human Proteoforms2021

    • Author(s)
      Yasushi Ishihama
    • Organizer
      Asian Conference on Analytical Sciences 2021 (ASIANALYSIS 2021)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ショットガンプロテオミクスのためのペプチド分離2021

    • Author(s)
      石濱泰
    • Organizer
      クロマトグラフィー次世代技術セミナー2021
    • Invited
  • [Presentation] N末端プロテオミクスによる新規翻訳開始点の同定2021

    • Author(s)
      西田 紘士、今見 考志、石濱 泰
    • Organizer
      日本プロテオーム学会2021年大会
  • [Presentation] オミクス解析のための微量分離技術の開発2021

    • Author(s)
      石濱泰
    • Organizer
      第41回キャピラリー電気泳動シンポジウム(SCE2021)
    • Invited
  • [Presentation] Analytical challenges to unveil human proteome and proteoforms2021

    • Author(s)
      Yasushi Ishihama
    • Organizer
      The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Pacifichem 2021)
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2022-12-28  

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