2021 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of joint regeneration mechanism by secretory sialic acid recognition lectin
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21H03055
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
山本 朗仁 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (50244083)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 伸典 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (20570196)
加納 史也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (40801626)
橋本 登 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (90712365)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 関節リウマチ / 分泌型シアル酸認識レクチン / 破骨細胞 / 滑膜線維芽細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
sSiglec-9による関節軟骨や骨の再生メカニズムを解明するために、以下の３つの研究課題を設定した。①CAIAおよびCIAモデルを用いて sSiglec-9標的細胞をin vivo関節炎で同定する。さらにin vitro培養系を用いて標的細胞を分離し性状解析する、② 標的細胞に対するsSiglec9の薬理活性・作用機序の解析、③ sSiglec9特異的受容体の同定、および関節再生課程における発現解析、機能解析。
課題①の研究成果；CAIAモデル炎症反応極期にsSiglec9FC蛋白を尾静脈投与し、抗FC抗体および抗sSiglec9抗体を用いた足関節の組織染色にて、sSiglec9FCの組織内分布を確認した。破骨細胞、一部の滑膜線維芽細胞にsSiglec9の強い集積を確認した。これらの細胞集団に対するsSiglec9の結合はin vitro FACSおよびIF解析でも確認できた。
課題②の研究成果；MCSF/RANKLによる骨髄細胞およびRAW細胞の破骨細胞分化過程にsSiglec9を作用させると、各種分化マーカー発現、ピットアッセイによる破骨機能、多核巨細胞形成能、アクチンリング形成機能が抑制されることを見出した。TNF処理した滑膜線維芽細胞にsSiglec9を作用させると炎症性サイトカインの産生や蛋白分解酵素の発現を抑制することを見出した。
課題③の研究成果；破骨細胞のライセートをsSiglec9FCにてpulldown IPし、LC/MSにて網羅的な蛋白解析を実施した。その結果3種類の細胞膜受容体を同定した。これらの分子が破骨細胞や滑膜線維芽細胞に発現することをQPCR解析にて確認した。さらにこれら3種類の受容体の細胞膜への発現をFACSにて確認した。3分子ともマクロファージから破骨細胞への分化過程や滑膜線維芽細胞をTNF刺激した際に発現量の上昇を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【課題１】CAIAおよびCIA損傷関節におけるsSiglec9標的細胞の同定；CAIAモデルにおいて、破骨細胞と一部の滑膜線維芽細胞がsSiglec9の標的細胞であることが明らかとなった。この成果により2021年度計画の50％が達成できた。一方CIAモデルでの解析は遅れている。CIAモデルは異常な自己免疫応答が病態の中心をなす。リンパ球や単球系細胞へのsSiglec9の結合が確認できると想定している。これまでにCIAモデルにsSiglec9投与を投与すると脾臓のTh17細胞の割合が減少し、Treg細胞が増加することを見出している。炎症性M1マクロファージにsSiglec9を作用させると、炎症性サイトカインの産生が抑制された。今後、CIAモデルを中心とした解析を進める。（研究進捗状況はおおむね予定通り）。【課題２】初代培養細胞を用いてsSiglec9の薬理活性・作用機序の解析；骨髄マクロファージ由来破骨細胞およびCAIA関節滑膜線維芽細胞にsSiglec9を作用させると、破骨細胞活性や線維芽細胞の炎症形質が抑制されることを確認した。また、sSiglec9が脾臓リンパ球や腹腔マクロファージの炎症形質を抑制することも確認した。（研究進捗状況はおおむね予定通り）。【2022年研究課題の前倒し実施】sSiglec9特異的受容体の同定；LC/MS解析により3種類の受容体型細胞膜分子を同定した。本研究課題は前倒し実施項目である。今後sSiglec9の薬理活性との関わり合いを検討する。（研究進捗状況はとても進んでいる）
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| Strategy for Future Research Activity |
sSiglec-9標的細胞の同定と性状解析； sSiglec-9-FCをCIAに静脈内投与し、抗FC抗体および抗sSiglec-9抗体を用いた経時的な組織化学解析によって、破壊した関節におけるsSiglec-9結合細胞を解析する。さらにin vitroで初代培養細胞調整し炎症性サイトカインで刺激後、sSiglec-9-FCとの結合をFACSやIFなどで評価する。sSiglec-9が結合する亜集団細胞をセルソーターで分離回収し、網羅的遺伝子発現解析にて性状を明らかにする。
関節破壊過程における受容体の発現解析；特定したsSiglec-9受容体の発現解析；CAIAおよびCIAモデルの関節破壊過程で同定したsSiglec-9受容体の発現細胞、発現変化を経時的に解析する。
関節軟骨および骨再生に果たす受容体の役割の解析；遺伝子改編マウスを製作し、in vivoでsSiglec-9受容体の機能抑制系を構築する。機能抑制マウスを用いたCAIAやCIAで、sSiglec-9の治療効果が消失するか検討する。in vitro細胞系でのsiRNAなどによるKnockdown実験により同定した受容体の機能解析を行う
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