2022 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集ツール臓器内直接送達システムによる生体内ダイレクトゲノム編集技術の開発
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21H03797
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小暮 健太朗 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (70262540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
南川 典昭 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (40209820)
野村 渉 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (80463909)
福田 達也 和歌山県立医科大学, 薬学部, 講師 (90805160)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | イオントフォレシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ゲノム編集ツールCRISPR-Cas9複合体（リボヌクレオプロテインRNP）を標的臓器細胞内へ直接送達可能な新規物理的送達システムの開発により、安全で効率的な生体内ダイレクトゲノム編集技術の確立を目的とする。研究代表者は、皮膚表面から微弱電流による皮内薬物送達技術（イオントフォレシスItP）により、皮膚のみならず肝臓表面からの直接的なsiRNA送達による遺伝子発現抑制に成功したことで、ItPによるin vivoダイレクトゲノム編集を発想した。だが巨大なRNPのItPには、臓器・細胞内送達の技術革新が必須なため、本研究ではRNPの臓器内浸透、細胞内取込とエンドソーム脱出の達成により、in vivoダイレクトゲノム編集技術を確立し、疾患モデルでの治療効果の検証から本システムの完成を目指す。
本年度は、①肝臓表面ItPによる臓器内核酸医薬送達メカニズムの検証（in vivo）、②RNPの微弱電流による細胞内送達とゲノム編集の詳細な条件検討（in vitro）、③CRISPRのItPによる肝臓内送達の検証（in vivo）、を実施した。①は、ItPによって肝臓組織細胞の細胞骨格が、皮膚細胞と同様に変化するのか否かを調べるため、ファロイジンを用いItP処理したマウス肝臓切片の重合化アクチンを染色したところ、ファロイジン蛍光が減少したことから、皮膚と同様に微弱電流によって重合化アクチンの脱重合促進が確認できた。②は、微弱電流処理48時間後にT7E1アッセイを行いゲノム編集を評価したところ、クロロキン共存下で切断バンドと思われるものが得られたが、毒性も見られたため、クロロキン濃度と処理時間、評価時間を詳細に検討した。③は、蛍光標識CRISPRを用い、肝臓表面でItPを実施し、肝臓切片の共焦点レーザー顕微鏡観察によりItPによる肝臓内へのCRISPRタンパク質の送達を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度計画していた3つの研究①肝臓表面ItPによる臓器内核酸医薬送達メカニズムの検証（in vivo）、②RNPの微弱電流による細胞内送達とゲノム編集の詳細な条件検討（in vitro）、③CRISPRのItPによる肝臓内送達の検証（in vivo）、を実施し、皮膚同様に微弱電流によって重合化アクチンの脱重合促進を確認、クロロキン濃度と処理時間、評価時間の詳細な検討、ItPによる肝臓内へのCRISPRタンパク質送達の確認を行ったが、ゲノム編集効率など改善すべき点があり、予想されていたことではあるが、当初予定よりも若干遅れていることから、「やや遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度には、マウス肝臓を対象臓器としてItPによるRNPの肝臓細胞内へのデリバリーとin vivoゲノム編集の達成を目指し、本年度の知見に基づいて、さらなる検討を行う。当初計画より若干遅れている点があるが、予想されていたことでもあり、目標のin vivoゲノム編集を達成できると考えている。
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Research Products
(2 results)
