2023 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on molecular mechanism of effector-mediated establishment of host specificity in plant pathogens and their application
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21H05032
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高野 義孝 京都大学, 農学研究科, 教授 (80293918)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大木 進野 北陸先端科学技術大学院大学, ナノマテリアルテクノロジーセンター, 教授 (70250420)
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (80380525)
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| Project Period (FY) |
2021-07-05 – 2026-03-31
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| Keywords | 植物病原菌 / 宿主特異性 / エフェクター / 炭疽病菌 / 耐病性作物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は新たに同定に成功したエフェクターEPC4について、ベンサミアナタバコにおけるPAMP誘導免疫の抑制能を調査した結果、EPC4がPAMPによって誘導される活性酸素生成を低下させる活性を有することを発見した。また、EPC1に関しては、本エフェクターを恒常的に発現させる形質転換シロイヌナズナを作成し表現型解析を実施した結果、EPC1発現シロイヌナズナでは、PAMP誘導活性酸素生成の低下が観察された。また、EPC3のN末端側フラグメント（EPC3-ND）はEPC3全長と同様に免疫抑制機能が保持されていることを明らかにしているが、このEPC3-NDに対してNMRを利用した動的構造解析の解析条件の最適化に成功させ、NMRスペクトルの解析を完了した。決定したEPC3-NDの立体構造は、5本のβストランドから成っており、2本と3本のストランドがそれぞれ逆平行βシートを形成し、これらの2枚のβシートが向かい合った立体構造をとることを明らかにした。さらに、EPC3とその標的分子であるBIP5に関しては、共免疫沈降解析に加えて、酵母ツーハイブリッド解析でも結合が検出され、その直接結合がより強く示唆された。EPC1の標的候補であるIOS1に関して、ウリ科作物であるメロンにおいてノックダウン解析を実施したところ、IOS1ノックダウン植物では、PAMP誘導活性酸素の生成低下が観察され、IOS1がメロンの免疫システムに関与することが示唆された。さらなる病原性エフェクターの探索に関しては、まず、ウリ類炭疽病菌と近縁種との比較オミクス解析より絞り込んだ6候補遺伝子の6重変異体が特定のメロン系統に対して病原性の低下を示すことを発見した。また、EPC1~4遺伝子の発現を正に制御する転写因子(TFV1と命名)を発見した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
計画どおり、発見しているEPCエフェクターおよび新たに発見したEPC4の植物免疫抑制能に関する知見が着実に得られている。また、構造解析については、EPC3-NDについてNMRによる構造解析を実施し、一連の多次元NMRデータを解析し、ほぼ全ての1H, 13C及び15Nの信号を帰属することができ、その構造決定に成功している。また、EPC1の標的候補として同定されたIOS1に関しては、本因子がメロンの免疫システムに関与することを明らかにしており、この結果はIOS1がEPC1の標的であることをさらに支持する。また、オービクラクレード内の別種との比較ゲノミクス、トランスクリプトミクス解析より、宿主特異性に関する新規エフェクターの探索を実施していたが、本年度の研究により、絞り込んだ6候補遺伝子の6重変異体が特定のメロン系統に対して病原性の低下を示すことを発見している。興味深いことに、この6重変異体はキュウリなどへの病原性は野生株と同等であり、特定のメロン系統への病原性に特異的に寄与していることが推察され、宿主特異性の概念を理解する上で重要な発見である。さらにEPC1~4遺伝子の発現を正に制御する新規の転写因子TFV1の発見に成功しており、TFV1破壊株を活用することで、宿主特異性に関与するエフェクター（EPCエフェクター）を網羅化できると期待される。また、酵母ツーハイブリッド解析においてもEPC3（およびEPC3-ND）とBIP5の結合が検出された結果を受けて、BIPの構造情報と、本研究で構造決定したEPC3-NDの構造情報に基づく結合領域予測を行い、その結果、結合に関わるBIP5のアミノ酸残基の有力候補を同定しており、解析中の段階である。以上より、本研究は順調に進展しており、一部に関しては当初の計画以上に進展していると評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに同定したEPC4も加えて、引き続きEPCエフェクターの機能および構造解析を推進していく。新たに発見したEPC4は、その単独遺伝子破壊株（104-T系統背景）がキュウリ、メロンへの病原性に関して劇的な低下を示す。このEPC4の植物免疫抑制活性を、メロンでの一過的発現系を用いて調査する。さらにその結果に基づき、必要に応じてEPC4を恒常的に発現する形質転換シロイヌナズナを作成し、その免疫反応を調査する。また、EPC3-NDについて、測定したNMR緩和時間データの解析を完了し、さらに分子内の運動性を明らかにする。一方、BIP5はHSP70 ファミリーに属することから、反応段階に応じて異なった複数のコンフォメーションを取ることが予測され、現在調製できた二量体のコンフォメーションとは異なったコンフォメーションで相互作用を確認する必要があり、そのための各種解析を実施する。EPC1に関して試料調製方法を確立して、溶液NMRによる解析の可能性を検討する。また、EPC1とIOS1のキナーゼドメインの共発現を試みる。複合体が得られ次第，結晶化試行とクライオ電顕解析を同時並行で進める。さらなる病原性エフェクターの探索に関しては、まず、ウリ類炭疽病菌と近縁種との比較オミクス解析より絞り込んだ6候補遺伝子の6重変異体が特定のメロン系統に対して病原性の低下を示すことを発見したが、この6遺伝子のどれが本菌の病原性に関与しているのかを特定する。また、EPC1~4遺伝子の発現を制御する転写因子TFV1の発見に成功しており、このTFV1破壊株と野生株の比較トランスクリプトミクス解析などより、新規の病原性エフェクター候補を選抜し、遺伝子破壊株を作出する。また、構造情報および複合体予測情報に基づき同定したEPC3（およびEPC3-ND）とBIP5の結合予測部位に関してその検証作業を進めていく予定である。
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