2022 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of mechanism for anti-aging effect of glucosamine

Research Project

Project/Area Number	21K05458
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	染谷明正順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (90167479)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	長岡功順天堂大学, 大学院医学研究科, 教授 (60164399) 鈴木香順天堂大学, 医学部, 助教 (90631929)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	グルコサミン / 細胞老化 / タンパク質凝集 / DNA損傷
Outline of Annual Research Achievements	グルコサミン(GlcN)は炎症性サイトカイン産生を抑制することで抗炎症効果を発揮する機能性食品素材と考えられている。炎症性サイトカインは細胞老化関連分泌形質（SASP）因子でもあり、老化誘導にも深くかかわっている。本研究課題ではGlcNの新たな機能として抗老化作用に着目し研究を進めている。令和4年度は老化誘導に関係する分子、オルガネラの状態を中心に調べた。ヒト肺癌由来細胞株A549をエトポシド（トポイソメラーゼII阻害剤、DNAを損傷）で老化誘導させ、細胞を染色した。令和3年度は老化マーカーである酸性βガラクトシダーゼ（SA-βgal）をX-galで染色していたが、①多重染色ができない、②感度が低い、③定量性がない、などの理由で蛍光色素SPiDER-βgalを用いた。細胞老化には、リボソームやリソソームの機能・形態異常、またタンパク質凝集が関わっている。そこでまず、これらオルガネラやタンパク質の状態を観察する実験系を確立した。そして老化細胞でどのように変化しているかを調べた。その結果、老化細胞ではタンパク質凝集(PROTEOSTAT蛍光試薬で検出した)が起こっていることが分かり、一部がリソソームマーカー(LAMP1)と共局在していた。さらに、老化とタンパク質凝集の関係を詳しく調べるため、細胞を接着させるスライドやコーティング素材を変えて調べた。その結果、接着の状態が異なると、老化の程度は同程度でも、細胞のオルガネラの形態やタンパク質凝集の状態が異なることが分かった。これらのことから、細胞老化は様々な刺激を介して起こるが、その状態は老化を直接引き起こす刺激(本研究ではDNA損傷)と、他のシグナル(本研究では細胞接着分子からのシグナル)との組み合わせによって細胞老化が起こるためのメカニズムが異なるを示唆していると思われる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 細胞老化を誘導すると、老化細胞だけではなく細胞死も起こる。そのため老化細胞と死細胞を分離するには7-14日の培養を必要とするため実験に時間を要している。また細胞染色を最適化するための予備実験に時間がかかった。これらの理由から実験に時間を要し実験に遅れが生じている。
Strategy for Future Research Activity	令和４年度の実験において、老化誘導シグナルだけではなく、細胞接着分子からのシグナルが、細胞の状態(タンパク質凝集や細胞内オルガネラの状態)に深くかかわっていることを示唆する結果が予想外に得られた。そこで、どのような細胞接着シグナルが伝達されると、老化細胞の状態が影響されるかを、まずRNAシーケンスで推測する。さらに質量分析法でタンパク質発現やリン酸化のプロファイルを調べる予定である。そして得られた結果を踏まえて、GlcNによる細胞老化の抑制に関わる分子やシグナル伝達経路、またGlcNの老化細胞の微細構造に及ぼす影響と細胞老化抑制との関係について調べる予定である。現在A549細胞を用いているが、進捗状況に応じて、老化に関わるシグナル分子の発現が異なるMCF7細胞も用いる。
Causes of Carryover	理由：細胞老化誘導方法を確立するのに時間を要している。また実験系の変更（X-galからより高感度の蛍光色素への変更）や染色の確立に時間を要した。さらに老化細胞の形態変化に細胞接着からのシグナルが関わっていることを示す結果を確実にするため時間を要した。そのためターゲット分子の同定や機能解析の実験が持ち越しとなり、これら実験に必要な試薬等の購入経費が次年度に持ち越されることとなった。使用計画：老化細胞検出用の蛍光試薬や抗体およびオルガネラの状態を調べるための試薬・抗体を購入予定である。またRNAシーケンスや質量分析に必要な試薬の購入ならびに分析料金に使用予定である。また老化シグナルの解析に必要な抗体、阻害剤、各種試薬の購入に使用予定である。