2021 Fiscal Year Research-status Report
清酒醸造における低温長期の並行複発酵を可能とする、緩慢な糖生成のメカニズムの解明
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21K05460
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
徳岡 昌文 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (30442544)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | オリゴ糖 / 清酒 / 発酵 / 糖化 / 糖転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
清酒より6種のオリゴ糖を精製しNMR解析により、ニゲロシルグルコース、セントース、イソマルトトリオシル(iG3)グルコース、iG3マルトース、iG3マルトトリオース、iG3マルトテトラオースであることを明らかにした。すべてこれまで清酒では見出されていない糖であり、iG3マルトテトラオースは新規構造オリゴ糖であった。また、麹菌Aspergillus oryzaeのα-グルコシダーゼ遺伝子破壊株で製造した清酒の分析より、ニゲロシルグルコースとセントースはAgdBにより、その他はAgdAにより醸造工程で合成されること、及びAgdAはニゲロシルグルコースを分解することが明らかとなった。これまでに解明されたオリゴ糖の構造から、非還元末端にAgdAによる糖転移で生成したイソマルトース型の分岐を持つ一群が存在することが明らかとなり、清酒中オリゴ糖の生成と分解には一定の規則があることが示唆された。
オリゴ糖の消化性については、以前研究で見出したDP7-1についてグルコアミラーゼによる分解実験を行った。DP7-1は非還元末端側に隣接型分岐（α-1,6結合）が存在するが、グルコアミラーゼにより一部が完全に、その他はDP6-1へと分解された。この結果より、非還元末端の隣接型分岐がグルコアミラーゼ耐性の要因であることが示唆され、清酒の糖の分解に影響していると予想された。
さらにDP6-1がagdA、agdBの遺伝子破壊に影響せずにDP6-1が清酒に残存した点に注目し、糖転移が生じないブタ膵臓α-アミラーゼにより澱粉を分解したところ、分解物からのDP6-1が検出された。DP6-1は隣接した分岐構造を持つことから、これまで澱粉中には存在しないとされていた隣接した分岐構造が存在することを示すことから、澱粉の微細構造を考える上で興味深い結果であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
清酒の主要なオリゴ糖の精製物が揃った上で消化性試験を実施する方が効率的と考え、2021年度予定していた消化性の解析は2022年度実施することにしたが、新規に6つのオリゴ糖の構造解析が進んだこと、2022年度実施予定のオリゴ糖の生成メカニズムについての知見が先行して得られていることから、概ね順調な進展とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は一部のみ実施した清酒オリゴ糖の消化性の解析について、オリゴ糖の精製物が揃ったことから、消化性の解析を進める。これまでの解析から清酒中のオリゴ糖は、重合度3以上については、非還元末端側にイソマルトースの分岐がある構造、隣接型分岐がある構造、イソマルトオリゴ糖、の3種に大別されることが分かった。そのため、すべてのオリゴ糖を対象とせずに、代表的なオリゴ糖について解析を行うことで、分解性の全体像を明らかにできると考えている。
オリゴ糖の生成メカニズムについては、遺伝子破壊株を用いた実験からAgdA、AgdBの重要性が既に分かっていることから、これら酵素のPichia pastorisによる組換え酵素の調製と、それらを用いたin vitro合成実験より生成機構の証明を行う。課題として、販売されているオリゴ糖は少なく、糖転移の受容体として用いることができるオリゴ糖が限られることから、特に隣接した分岐を持つオリゴ糖が糖転移で生成するかについては、13Cラベル化マルトースを用いた、清酒醪ろ液を用いた糖転移試験を実施する。
アミロペクチンの残渣については、2021年度結果より、米澱粉中に隣接した分岐が存在することが示唆されたことから、2022年度はオリゴ糖の定量に基づく分岐の割合などを含めた詳細な解析を進める。
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