2021 Fiscal Year Research-status Report

食用ラン藻スピルリナのシュードビタミンB12の栄養欠点の克服

Research Project

Project/Area Number	21K05473
Research Institution	Tokyo University of Agriculture
Principal Investigator	谷岡由梨東京農業大学, 国際食料情報学部, 准教授 (30553250)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	Arthrospira platensis / 最小生育阻止濃度 / ビタミンB１２ / シュードビタミンB１２
Outline of Annual Research Achievements	スピルリナ（Arthrospira platensis　NIES-３９）は、古くから食経験があり、栄養補助食品や青色色素フィコシアニンの原料として産業的に広く利用されている。しかし、将来的な人口増加により、これまで通りの食料増産が見込めない中、スピルリナを始めとした微細藻類の需要は増すと考えられる。スピルリナは、タンパク質やビタミン、ミネラルが豊富であるが、ビタミンB１２ではなくヒトにおいてビタミンとして機能しないシュードB１２を合成することが唯一の栄養欠点となっている。本研究では、スピルリナの産業利用に欠かせない形質転換系を検討するために、今年度は形質転換の際に行う各種薬剤選抜の最小生育阻止濃度を検討した。さらに、実験モデルラン藻として使用されているSynechocystis sp. PCC6803を用い、シュードB１２合成経路をB１２合成経路へ変換するために、合成経路に重要な遺伝子導入を試みた。スピルリナの各種薬剤に対する最小生育阻止濃度を検討したところ、スペクチノマイシンとクロラムフェニコールは終濃度１～２μg/ml、ハイグロマイシンは終濃度４～８μg/mlで生育が阻害された。一方で、ゲンタマイシン、カナマイシンは終濃度10μg/mlでも耐性を示すことが明らかになった。スピルリナはカナマイシン耐性遺伝子を有していることからも実験結果は一致していた。PCC6803株へB12合成に重要なBluB遺伝子ホモログを導入し、フォトダイオードアレイで解析したところ、B12の生成を確認することはできなかった。たんぱくの発現はウェスタンブロッティングで確認できことから、今後、BluB活性の測定条件を確立し、酵素活性の測定を実施する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 現在までに、スピルリナの各種薬剤に対する最小生育阻止濃度を明らかにすることができた。一方で、PCC６８０３へ導入したBluB遺伝子ホモログは、ウェスタンブロッティングで確認したところ発現していた。しかし、ラン藻Fissherellaが有するホモログであったことから、BluBとしての機能を有していない可能性などが考えられる。したがって、酵素活性を測定し機能しているか確認する必要がある。また、下方配位子合成は、塩基合成に関与するBluBとその下流にあるCobTなど数段階の酵素によって行われることから、BluBだけでなく、CobT遺伝子の導入も検討している。さらに、BluBは、根粒菌のBluBがよく研究されていることから、根粒菌のBluBをPCC６８０３へ導入することも検討している。
Strategy for Future Research Activity	ラン藻Fissherellaが有するBluBホモログの酵素活性を測定するために、BluB活性の測定法を検討し、機能的な酵素かどうか確かめる。さらに、実験モデルラン藻PCC６８０３へ根粒菌のBluB遺伝子を導入することで、シュードB１２からB１２への変換を試み、ウェスタンブロッティングやフォトダイオードアレイ検出器を使用して生成されたコリノイドがB12かシュードB12か確認する。ラン藻には古細菌由来のCobT遺伝子ホモログが存在している。CobTは下方配位子塩基をB12へ組み込む酵素であり、スピルリナCobTを大腸菌で大量発現させ、種々の下方配位子塩基に対する基質特異性を明らかにする。
Causes of Carryover	次年度使用額は、当該年度で購入したい消耗品と購入額が一致せず生じた。翌年度分の消耗品費額と合算することで、計画的に使用していく予定である。購入予定物品は、主に遺伝子実験用試薬やB12定量用培地、プラスチック器具類である。また、遺伝子解析に必要なプライマーやシークエンス解析に使用する予定である。