2023 Fiscal Year Research-status Report

比較ゲノミクスから探る育種モデル食用菌の生殖成長相転換機構の全容解明

Research Project

Project/Area Number	21K05530
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	種坂英次近畿大学, 農学部, 教授 (80188391)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	築山拓司近畿大学, 農学部, 准教授 (00423004) 白澤健太公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 室長 (60527026)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	担子菌 / エノキタケ / 子実体形成 / 遺伝子発現 / 機能解析
Outline of Annual Research Achievements	菌床栽培における低温刺激による子実体形成に対して、変異株では低温下でも子実体を形成しないという現象をフラスコ内の液体培地上で再現した。また、この培養系を用いて、RT-qPCR解析に加えてRNA-seq解析からhyd1やFDSなど数種の子実体形成関連候補遺伝子を特定してきた。さらに、過剰発現およびノックアウトの両面からの遺伝子機能解析系を確立しつつある。子実体形成不全変異株(d3)のプロトプラスト-PEG法によるFDS過剰発現カセットの導入によって、菌床培地での子実体形成能が回復することを観察している。一方、遺伝子ターゲティングによるノックアウト株の作成にあたって、真菌類のDNA修復は非相同末端結合が主な経路であり、相同組換えによる遺伝子ターゲティングの効率は極めて低いと考えられる。そこで、ウシグソヒトヨタケのゲノムデータベースを参照し、非相同末端結合に関わる３つの遺伝子（ku70, ku80, およびLingIV）と相同な配列がエノキタケゲノムにおいても存在することを確認し、このうちLigIVを破壊した非相同末端結合破壊系統の作出を試みてきた。その結果、相同組換えによる置換を期待して得られた形質転換体904系統のうち、1系統のみにおいてゲノムDNAの置換およびRT-PCRによるLigIV発現の無効化を確認した。この結果はアカパンカビのような真菌類と同様にエノキタケにおいても非相同末端結合がDNA修復における主要な経路であることを示している。得られた破壊系統を用いることによって相同組換えによる遺伝子ターゲティング（ノックアウト系統の作成）効率の飛躍的な向上が期待される。フラスコ中の液体培地から菌糸体を分取し核酸抽出を容易にする培養系、および過剰発現とノックアウトの遺伝子機能解析系を確立した現在、育種モデル食用菌エノキタケを用いた生殖相転換機構の全容解明は既に実証段階にある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ここまでの研究で、子実体形成株（野生株）および子実体形成不全株の発現解析比較から数種の子実体形成関連遺伝子が同定された。しかしながら、これら遺伝子の発現が同調することから、発現を制御するマスタースイッチの存在が推定され、さらに網羅的な解析が必要となった。そこで、子実体形成株群と形成不全株群のRAD-seq解析を計画した。ここで、両株群の遺伝的背景をできるだけ均一にするために、子実体形成不全株からの稀な子実体と担子胞子の採取を試みている段階にある。
Strategy for Future Research Activity	子実体形成株群と形成不全株群を作成し、RAD-seq解析により、子実体形成関連遺伝子群を特定する。さらに、候補遺伝子のノックアウトおよび過剰発現により、機能解析を実施し、子実体形成関連遺伝子の発現を制御するマスタースイッチを見出す。
Causes of Carryover	子実体形成株群と形成不全株群の作成が計画通りに進まず、RAD-seq解析による候補遺伝子群の網羅に至らなかったため。