2022 Fiscal Year Research-status Report

膜融合のin vitro再構成によるミトコンドリア外膜融合機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K06054
Research Institution	Kurume University
Principal Investigator	伴匡人久留米大学, 分子生命科学研究所, 准教授 (00579667)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ミトコンドリア / 膜融合 / GTPase / リポソーム / 試験管内再構成
Outline of Annual Research Achievements	細胞内のエネルギー生産工場として機能するミトコンドリアは、融合・分裂によりその形態を制御する動的な細胞小器官である。融合・分裂は形態のみならず、ミトコンドリアの多彩な機能の制御に必須の現象であるが、融合・分裂に中心的な役割を持つGTP加水分解タンパク質（GTPase）がどのように機能するのか？その詳細については不明な点が多く残されている。これまでに精製タンパク質と、人工脂質二重膜小胞（リポソーム）を用いた膜融合反応の試験内再構成により、ミトコンドリア内膜融合の分子機構解明に努めてきた。本研究では哺乳動物のミトコンドリア外膜融合GTPase mitofusin(Mfn)の膜融合における膜結合・膜融合の駆動力、分子機構を明らかにするために、詳細解析を行っている。令和4年度は、令和3年度に確立したMfn2による膜融合の試験管内再構成を使い、膜融合反応の詳細解析を行った。まず膜融合におけるGTP加水分解の寄与を解析した。Mfn2による膜融合は、GTPを加えた時にのみ観察され、GDP及びGTP非加水分解アナログを加えた時には観察されなかった。培養細胞や単離ミトコンドリアを用いた先行研究と同様に、Mfn2による膜融合は、GTP加水分解に依存することを示した。またミトコンドリア内膜融合GTPase OPA1とは異なり、融合する両側の膜にMfn2が含まれる場合に、有意な膜融合が観察された。続いて、膜融合反応における脂質膜組成の解析を行った。Mfn2はミトコンドリア以外にも、小胞体に局在し、ミトコンドリアと小胞体の繋留に機能することが報告されている。小胞体膜をモデルとしたリポソームに、Mfn2を挿入したところ、GTP存在下でも膜融合の著しい低下が観察された。これらの結果から、Mfn2による膜融合は、GTP加水分解及び、脂質膜の脂質組成に依存することが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和3年度に確立したMfn2による膜融合の試験管内再構成を使い、Mfn2による膜融合における脂質の役割について、新たな知見を得ることができた。またリポソーム膜中におけるMfn2の会合状態の解析に着手しており、次年度は、Mfn2の会合状態と膜融合に関する知見が得られる見込みである。
Strategy for Future Research Activity	次年度は、膜融合の前段階である膜結合反応の詳細解析を行い、Mfn2による膜融合反応の全貌の解明を進めていきたい。本研究の先行研究で使用した磁気ビーズを用いた解析では、膜融合と膜結合の識別が難しいことから、新規解析法及び、解析に適したMfn2を含むリポソーム調製の確立にも取り組んでいく予定である。
Causes of Carryover	次年度は、新規の膜結合解析に向けた機器備品及び、Mfn2を含むリポソームの調製に適した界面活性剤のスクリーニングを予定しているため