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2022 Fiscal Year Research-status Report

大規模並列レポーターアッセイ法による転移因子進化メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number 21K06119
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

井上 詞貴  京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (60525369)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) BOURQUE GUILLAUME  京都大学, スーパーグローバルコース医学生命系ユニット, 招へい研究員 (80890566)
Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
Keywordsエンハンサー / 転移因子 / MPRA / ゲノム進化 / エピゲノム / iPS細胞 / 神経前駆細胞
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、転移因子機能の進化を明らかとするため、大規模並列レポーターアッセイ法(lentiMPRA)を用い、iPS細胞、神経前駆細胞における転移因子のエンハンサー活性を大規模並列的に解析する。
先行研究で行ったエピゲノム解析から、MER11、MER34、MER52が iPS細胞および神経前駆細胞においてエンハンサー活性を持つと予想されたため、これらの転移因子ファミリーのバリアント合計約17,000配列を含むMPRAライブラリを作製した。これをヒトiPS細胞および神経前駆細胞へ導入し、細胞から回収したDNAおよびRNAバーコードについてNextSeqによるシークエンシングを行った。バイオインフォマティクス解析パイプライン(MPRAflowおよびMPRAnalyze)を用い、DNAおよびRNAバーコードを定量した。3実験群で高度に再現性があること、ポジティブコントロール配列、ネガティブコントロール配列が予想通りの挙動であること、既知のエピジェネティック修飾と相関があることを確認した。MER11の多くがiPS細胞において特異的に高いエンハンサー活性を持つことを見出した。従って、MER11サブファミリーの詳細な系統樹を作成し、その分岐とエンハンサー活性の獲得・消失の関連を解析した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、MPRAライブラリの作製・クオリティチェック、MPRA実験条件最適化、DNA/RNAバーコードシークエンシング、バイオインフォマティクス解析を終了している。
期待通り、iPS細胞において高いエンハンサー活性を呈する転移因子を同定することに成功している。再現性や、コントロール配列が期待通り挙動することも確認している。

Strategy for Future Research Activity

引き続きMPRAの詳細なデータ解析を行う。特に、MER11サブファミリーのエンハンサー活性を担う配列・塩基、転写因子結合モチーフを明らかとする。エンハンサー活性の変化に関連する重要な塩基置換を系統的に理解する。これにより、MER11の機能の進化的変遷とその分子機構を明らかとする。また、ヒト、チンパンジー、カニクイザルのMER11配列比較を行うことで、種分岐後の変異獲得と機能の関連を検討する予定である。また、得られた結果を多角的に検証するため、ルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、CRISPRiによる機能解析を行う予定である。

  • Research Products

    (9 results)

All 2023 2022 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 5 results) Presentation (2 results) (of which Invited: 2 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] マギル大学(カナダ)

    • Country Name
      CANADA
    • Counterpart Institution
      マギル大学
  • [Journal Article] Characterization of De Novo Promoter Variants in Autism Spectrum Disorder with Massively Parallel Reporter Assays2023

    • Author(s)
      Koesterich Justin、An Joon-Yong、Inoue Fumitaka、Sohota Ajuni、Ahituv Nadav、Sanders Stephan J.、Kreimer Anat
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 24 Pages: 3509~3509

    • DOI

      10.3390/ijms24043509

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Machine learning dissection of human accelerated regions in primate neurodevelopment2023

    • Author(s)
      Whalen Sean, Inoue Fumitaka, Ryu Hane, et. al.
    • Journal Title

      Neuron

      Volume: 111 Pages: 857~873.e8

    • DOI

      10.1016/j.neuron.2022.12.026

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Transcription factor binding site orientation and order are major drivers of gene regulatory activity2023

    • Author(s)
      Ilias Georgakopoulos-Soares, Chengyu Deng, Vikram Agarwal, Candace S. Y. Chan, Jingjing Zhao, Fumitaka Inoue & Nadav Ahituv
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 14 Pages: 2333

    • DOI

      10.1038/s41467-023-37960-5

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] High-throughput characterization of the role of non-B DNA motifs on promoter function2022

    • Author(s)
      Georgakopoulos-Soares Ilias、Victorino Jesus、Parada Guillermo E.、Agarwal Vikram、Zhao Jingjing、Wong Hei Yuen、Umar Mubarak Ishaq、Elor Orry、Muhwezi Allan、An Joon-Yong、Sanders Stephan J.、Kwok Chun Kit、Inoue Fumitaka、Hemberg Martin、Ahituv Nadav
    • Journal Title

      Cell Genomics

      Volume: 2 Pages: 100111~100111

    • DOI

      10.1016/j.xgen.2022.100111

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Massively parallel reporter perturbation assays uncover temporal regulatory architecture during neural differentiation2022

    • Author(s)
      Kreimer Anat、Ashuach Tal、Inoue Fumitaka、Khodaverdian Alex、Deng Chengyu、Yosef Nir、Ahituv Nadav
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 13 Pages: 1504

    • DOI

      10.1038/s41467-022-28659-0

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 転移因子エンハンサーバリアントの大規模機能解析2022

    • Author(s)
      井上詞貴
    • Organizer
      第45回日本分子生物学会年会
    • Invited
  • [Presentation] 大規模並列レポーターアッセイによるノンコーディングゲノム解読2022

    • Author(s)
      井上詞貴
    • Organizer
      NGS EXPO
    • Invited
  • [Remarks] 京都大学ASHBi 井上研究室(Bourqueグループ)

    • URL

      https://ashbi.kyoto-u.ac.jp/lab-sites/inoue_lab/

URL: 

Published: 2023-12-25  

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