2021 Fiscal Year Research-status Report
病原性連鎖球菌に由来する細胞傷害因子の構造機能解析と感染制御への応用
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21K06655
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| Research Institution | Suzuka University of Medical Science |
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Principal Investigator |
大倉 一人 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (00242850)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田端 厚之 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 准教授 (10432767)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体膜 / 感染症 / 細胞溶解毒素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）Streptococcus pseudopneumoniae (SPpn)はミチス群レンサ球菌(MGS)に属する新しい菌種でS. pneumoniae (SPn)やS. mitis (SM)と近縁である。SPpnゲノムにはコレステロール依存性細胞溶解毒素(CDC)等の病原因子の遺伝子が存在するが、ヒトへの病原性は明らかでない。本研究ではSPpnで報告されたリパーゼドメイン、タンデムに位置するCDC由来のレクチンドメイン、CDCの受容体認識ドメインなどの複数の機能ドメインを有する新規遺伝子の翻訳産物をMitilectin(MLC)と命名し検証した。
２）A群レンサ球菌はストレプトリジンO（SLO）とストレプトリジンS（SLS）を産生する。SLSの構造機能解析からSLS産生に関わる遺伝子群（sag operon）が特定し、成熟型SLSがチアゾール環やオキサゾール環などのヘテロ環構造を分子内に形成する機構と意義について検証した。このような分子は、thiazole/oxazole-modified microcins（TOMMs）と称される。
３）広域分子追跡および定位破壊力をもつボロントレースドラッグ創出を試行した。すなわち、終末糖化産物(AGE)のモデルとしてウシ血清アルブミン(BSA)を標的として、分子中にボロンを含むUTX-51誘導体のBSAとの反応性および熱中性子と併用した際のBSAの崩壊度合を解析した。
４）ミトコンドリア内膜の酸化的リン酸化反応を指標としたリアルタイム薬物放出の検知系構築を試行した。アルギン酸ゲルを薬物担体に見立て、脱共役剤SF6847を封入したゲルビーズ(SF beads)を作成。SF beadsから溶出したSF6847量をミトコンドリア酸素消費速度で算定する系を構築し、非ステロイド性消炎鎮痛剤(NSAID)メフェナム酸(MEF)、ジクロフェナク(DIC)の担体からの放出特性を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）SPnやSMでもmlc遺伝子保有株が確認され、SPpnとSMのMLC産生株ではmlc遺伝子の転写翻訳産物は分泌型と菌体表面結合型で存在した。大腸菌で調製したMLC組換え体はヒト由来株化細胞に対し結合性を示すが、ヒト由来赤血球や株化細胞にへは障害性は示さず、MLCは宿主細胞への菌体の接着に寄与し、結合性はタンデム型レクチンドメイン構造に依存した。
２）成熟型SLSに特徴的なヘテロ環構造の形成に関して検証を進めている。sagA遺伝子にコードされるSLS前駆体は、sagCとsagDの転写翻訳産物の作用によってcyclodehydrationを受け、その後、sagBの転写翻訳産物の作用によってdehydrogenationを受け、thiazole環（Cys-Cys）やoxazole環（Phe-Ser, Gly-Ser, Thr-Thr）が分子内に形成される。sagB, sagC, sagDの転写翻訳産物によりヘテロ環構造が形成されたSLS前駆体は、sagEの転写翻訳産物によりリーダーペプチドが切断されて成熟型SLSとなる。成熟型SLSは、sagG, sagH, sagIの転写翻訳産物であるABC transporterの作用によって、菌体外に分泌される。
３）相互作用解析からUTX-51誘導体はBSA分子中心近辺に填まり込むことが確認できた。UTX-51が最も強固にBSAと相互作用し、熱中性子照射によってBSAがUTX-51濃度依存的に破壊された。
４）非ステロイド性消炎鎮痛剤(NSAID)メフェナム酸(MEF)、ジクロフェナク(DIC)の担体からの放出特性を解析した。SF beadsにおいて放出したSF6847の濃度に依存して酸素消費速度の増大を確認できた。SF6847の放出特性はゲル化時間によって調節でき、封入する薬剤の放出をゲル作成段階で調節しうると考えられた。MEFまたはDICをアルギン酸ゲルビーズへ封入した際の放出を解析したところ、MEFは徐々に放出する事を確認した。一方、DICはMEFとは対照的に急激に放出する事をみとめた。
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| Strategy for Future Research Activity |
SLS関連遺伝子のうち、sagFの転写翻訳産物の機能は不明であり、これまでの解析から”Immunity protein”として、菌体内で形成された成熟型SLSの傷害作用から自身を保護する機能を示すのではと予想し検証を進めている。SLSはA群レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）だけでなく、他の化膿性レンサ球菌群（S. dysgalactiae, S. iniae, S. equi）の溶血因子としても確認されて、A群レンサ球菌に限定された溶血因子ではないことを検証する。
SLSは溶血活性だけでなく、細胞傷害性も示すことを検証する。これまでに、HSC-2（ヒト由来口腔扁平上皮ガン細胞株）と菌を共存させた条件で検討し、顕微鏡観察とCCK-8アッセイを実施したところ、溶血株（NCTC10713）では細胞に水疱（ブレブ）の形成が確認（OD600=0.01の結果）され、さらに傷害が進むと細胞内容物が漏出して細胞核のみが残った状況（OD600=0.1の結果）となった。このような結果は、SLSを産生しない非溶血株（NCTC10713）では観察されなかった。
β溶血性Streptococcus anginosus subsp. anginosus（β-SAA）が産生するSLSのアミノ酸配列の差異を検証する。β-SAA以外のアンギノーサス群レンサ球菌（SCP, SCV, SAW, SCC）が産生するSLSのアミノ酸配列は比較的保存されている。しかしながら、β-SAAが産生する2種のSLSは、それぞれ分子のC末側のアミノ酸配列が異なる。このアミノ酸配列の差異がβ-SAAが産生するSLSの活性を特徴付けている可能性も考えられ、検証を行う。また、SLSの活性発揮に必須のヘテロ環構造の形成に寄与するアミノ酸に注目すると、A群レンサ球菌（SPy）由来SLSと比較してアミノ酸欠失などが確認される。このような配列的な特徴も、β-SAAが産生するSLSの特徴を規定する要因かもしれず、解析を要する。
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| Causes of Carryover |
構造解析端末の保守部品が、世界的な半導体不足の煽りをうけて欠品のため繰り越しが生じた。順次手配を進めて行く予定である。
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Research Products
(5 results)
