2023 Fiscal Year Research-status Report

Molecular analysis of Prader-Willi syndrome by model mice

Research Project

Project/Area Number	21K07848
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	木住野達也長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医歯薬学総合研究系), 准教授 (70315232)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	プラダーウィリー症候群 / Snrpn / CTCF
Outline of Annual Research Achievements	ゲノム編集技術を用いてプラダー・ウィリー症候群責任領域の複数の遺伝子の遺伝子改変マウスを作製した。2021年度にはSnrpn, Snord116, Snord115の遺伝子の欠失マウス、2022年度はMkrn3,Magel2, Ndnの遺伝子改変マウスを作製し、2023年度にはSnrpn-Ndn間を様々な長さで欠失したマウスを作製した。 2023年度に作製したSnrpn-Ndn間の、Ndnよりの約1/3の領域のを欠失したマウスでは、母親アレルの欠失したマウスは体重増加の異常を認めなかったが、父親アレルの欠失で新生児期体重増加不良を認めた。同領域領域はmiRNAが存在するため、miRNAの存在する領域に絞って欠失マウスを作製したところ、miRNAの発現は父親アレルのみからであった（母親性インプリンティング）が、体重減少は見られなかった。従って同領域の欠失による新生児期体重減少の原因はmiRNAではなく、他の遺伝子によるものと考えられた（日本小児神経学会、日本分子生物学会で発表）。現在、さらに候補領域を狭めて欠失マウスを作製中である。 2021年度に作製したSnrpn exon1上流6kbからエクソン1までを欠失したマウスは新生児期致死ではなかったが、新生児期体重増加不良をみとめた。この領域をさらに短く欠失させたマウスでは、CTCF結合領域と考えられる約200bpの欠失でも新生児期体重増加不良を認めた。この約200bpの領域の欠損は、周囲の遺伝子(Ndn, Magel2, Snord116など)の発現に影響を与えておらず、他の遺伝子の関与が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ゲノム編集による遺伝子改変マウスの作製は、高効率で作製できる手法を確立し順調に進んでいる。これまでは広い領域の欠失マウスを作製して表現型を解析してきたが、欠失領域を狭め、さらに候補領域を絞った遺伝子改変マウスの作製できており、表現型の違いから病態解析が進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	ゲノム編集技術を用いてプラダー・ウィリー症候群責任領域のSnrpn exon1上流を様々な長さで欠失したマウスを作製し、新たなプラダー・ウィリー・インプリンティングセンター欠失マウスの作製をめざす。また新生児期致死及び新生児期体重増加不良を認めるマウスのrescueとして、母親アレルを欠失したアンジェルマン症候群・インプリンティングセンター欠失マウスの作製を開始し、交配によりrescueできないか検討する。さらにはこれら作製された様々なマウスの新生児脳からRNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いたRNA-seqを行い、新生児期期致死、体重増加不良の原因遺伝子の検索を行う。
Causes of Carryover	遺伝子改変マウスの作製が予想外に順調に進み、crRNA、ドナーDNA、CAS9などの高価な試薬の消費が予定額より少なく済んだため当該余剰金が生じた。翌年度は当初の予定通り、エピジェネティック解析を行う。次年度に繰り越した経費は、作製されたマウスの脳のRNA-seqを次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子発現解析の費用に充てる予定である。