2021 Fiscal Year Research-status Report
Molecular therapy of replication-competent adenoviruses targeting characteristic gene mutations found in mesothelioma
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21K08199
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
田川 雅敏 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任教授 (20171572)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 悪性中皮腫 / p53経路 / FAK経路 / MDM2分子 / アデノウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性中皮腫は予後不良で、従来の治療法では有効性が乏しいため、新規治療開発の必要性は高い。一方ゲノム解析によって、同疾患には特徴的な遺伝子変異が存在することが明らかにされたので、当該変異を有するp53およびNF2分子を標的とする医薬品の開発に資する研究を実施した。悪性中皮腫ではp53が正常型でINK4A/ARF領域の欠損しているため、p53経路が機能的に不活化している。そこで、組換えアデノウイルス（Ad）を用いて正常型p53分子を発現させると、悪性中皮腫細胞に細胞死が誘導された。さらにE1B-55kDa分子を欠損させた増殖性のAd（Ad-E1B）を用いたところ、悪性中皮腫ではp53の遺伝子型によらず細胞死が誘導された。Adの初期応答遺伝子であるE1A分子は、感染細胞にp53分子を誘導するが、E1B-55kDa分子はp53分子をユビキチン化し同分子を不活化させる。Ad-E1Bを感染させた悪性中皮腫細胞では、確かにE1A分子によってp53分子が増加しており、p53が野生型の細胞では同経路の活性化による細胞死が誘導され、一方変異型の細胞ではp53分子の発現上昇はなく、ウイルス増殖による細胞死が誘導されていた。そこで、p53分子のユビキチン化を担うMDM2分子の阻害剤であるnutlin-3aとAd-E1Bを併用すると、野生型の悪性中皮腫細胞では、p53分子発現が上昇し、殺細胞作用において相乗効果が認められた。もう一方のNF2遺伝子変異は、Hippo経路の異常亢進に直結している。Hippo経路の異常は複数のがんの悪性化に関与する経路を活性化するが、その中の一つであるFAK経路の阻害剤であるdefactinibによる抗腫瘍効果を検討した。その結果、同薬剤はFAK分子のリン酸化を阻害し、悪性中皮腫細胞のp53発現を上昇させ、nutlin-3aと相乗的な殺細胞効果を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Adを用いて正常型p53分子を悪性中皮腫細胞に発現させると、p53の遺伝子型によらず細胞死が誘導された。このことは同遺伝子が変異型であっても、p53経路から細胞死に至る経路が正常であることを意味している。したがって、悪性中皮腫ではp53遺伝子変異に拘わらず、p53発現上昇によって抗腫瘍効果が得られ、同経路の活性化が当該疾患の治療薬開発に重要であることを示唆している。Adの感染初期にE1A分子が発現するが、同分子はp53分子の転写因子であり、感染細胞におけるp53分子の発現上昇を誘導する。一方同じ初期応答遺伝子であるE1B-55kDaは、p53と結合し失活させるため、同分子を欠損させたAd-E1Bではp53発現をより増加させる。したがって、Ad-E1Bは悪性中皮腫に有効であると想定できる。一方p53分子の分解にはユビキチン化が関与し、このユビキチン化に関わるMDM2分子の阻害剤は、内因性のp53分子の発現を上昇させる。同阻害剤であるnutlin-3aは、p53遺伝子が野生型の悪性中皮腫細胞に対して殺細胞効果を誘導し、Ad-E1Bとnutlin-3aの併用は、p53発現レベルを単独使用よりも高め、相乗的な細胞傷害活性を示した。この実験結果によって、p53経路の活性化は悪性中皮腫細胞の治療に関して、極めて重要な位置を占めていることが確認できた。また、FAK経路の阻害剤であるdefactinibは、細胞傷害活性のみならずp53発現も上昇させ、nutlin-3aとの併用効果を発揮したが、この結果はHippo経路とp53経路のクロストークが存在する可能性を示している。しかし、NF2遺伝子が変異型の細胞にもdefactinibは野生型と同様な殺細胞効果を誘導しており、このことはFAK経路の活性化とNF変異によるHippo経路の亢進とが必ずしも一致しないことを意味している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ad-E1BとMDM2阻害剤であるnutlin-3aの相乗効果があったので、当該効果に関するp53経路の重要性を確認するために、他のMDM2阻害剤であるRG7112との併用効果の有無について検討する。また、MDM4分子はMDM2分子を介してやはりp53分子のユビキチン化に関与する。そこでMDM4阻害剤でもあるHSP90阻害剤、NSC207895とAd-E1Bとの併用効果を、p53発現に与える影響とともに検討する。またp53経路における細胞死が、Ad-E1BあるいはMDM2阻害剤との併用効果に関して、どのような影響を与えるか、p53発現を阻害するsi-RNAを使用して解析を進める。一方で、p53変異細胞についても同様な解析を行う。またAdの増殖におけるp53経路の影響について、TCID50法を用いて検討する。さらに感染細胞におけるAdの増殖には多くの細胞側因子が関わっているが、このなかでどのような因子がE1B-55kDaを欠くAd-E1Bの増殖に関与するのかを解析し、p53の発現上昇との相関においてどのような経路が重要かを検討する。Hippo経路に関連する、低分子G蛋白の一つであるRho分子およびmTOR経路の阻害剤に関して、抗腫瘍効果を検討し、p53経路との関連性をさらに追及する。上記の相乗効果等について、悪性中皮腫細胞の胸腔内投与によるin vivo 動物実験モデルの系を用いて検討し、臨床的な有用性の有無について解析を進める。
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| Causes of Carryover |
（理由）本年度の研究が比較的順調に進行したが、Ad-E1Bの作成効率が予想外に良好で、当該ベクター作製に関する支出が少なくなっている。また低分子化合物である阻害剤は、すでに購入していた薬剤をできるだけ使用したため、新規購入品が少なかった。また発現検討に使用するその他の生化学的試薬等も、既存の試薬を使用できたため、当該費用は比較的低く抑えることができた。
（使用計画）次年度は、多く細胞を使用するため、培養関係の費用の増加が見込まれ、Hippo経路の各種阻害剤をはじめ、さらに多くの阻害剤の購入を予定している。またp53のsi-RNA購入が必要であり、特にp53経路とHippo経路等のクロストークを検討するため、当該経路の各機能分子の発現を解析する必要がある。そのために、各種リン酸化抗体の購入を予定している。またin vivo実験用のマウスの購入と飼育に関する費用も必要である。
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[Journal Article] An MDM2 inhibitor achieves synergistic cytotoxic effects with adenoviruses lacking E1B55kDa gene on mesothelioma with the wild-type p53 through augmenting NFI expression2021
Author(s)
Nguyen, T.T.T., Shingyoji, M., Hanazono, M., Zhong, B., Morinaga, T., Tada, Y., Shimada, H., Hiroshima, K. and Tagawa, M.
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Journal Title
Cell Death Dis
Volume: 12
Pages: 663
DOI
Peer Reviewed / Open Access
