Trained immunityによるアトピー性気管支喘息根治療法の開発

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08440
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 深堀 範 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (10849459)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾長谷 靖 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (40399762) ; 福島 千鶴 長崎大学, 病院(医学系), 教授 (50380978) ; 迎 寛 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (80253821)
• Project Period (FY): 2022-11-15 – 2027-03-31
• Keywords: 免疫寛容 / 制御性T細胞 / 樹状細胞 / アトピー性喘息 / TLR2

Outline of Annual Research Achievements

これまではマウス骨髄よりmDC(Myeloid Dendritic cells)を誘導していたが、新たにマウスの脾臓組織からmDCを磁気ビーズ法を用いて分離する試みを行った。その際には、EasySep 8482; Mouse Pan-DC Enrichment Kit IIを使用し、このキットに含まれる抗体カクテルとビオチン化mousePDCA-1抗体を同時に反応させることでpDC (plasmacytoid DC)を除去し、さらに mouse CD11c を使用したEasySep 8482; Release Mouse PE Positive Selection Kit (ST-17656) を用いてcDCを単離した。そして、単離したmDCを、それぞれにダニ抗原のみを添加した群、TLR2(Toll-like receptor 2)リガンド(Pam3CSK4)のみを添加した群、およびダニ抗原とPam3CSK4の両方を添加した群に分け、それぞれを培養した。その後、Flow cytometryを用いてmDC表面のTLR2レセプターの発現強度を比較した。その結果、ダニ抗原単独で刺激されたmDCと比較して、ダニ抗原とPam3CSK4で共刺激されたmDCでは細胞表面のTLR2発現が増強することを確認した。また、上記の手法で作成した樹状細胞に、マウスの脾臓組織からEasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kitを用いて単離してきたnaive CD4 T cellを1:10の割合でダニ抗原刺激下に共培養し、培養上清のIL-10とTGF-b濃度をELISA法により測定した。その結果、ダニ抗原単独刺激培養群と比較して、ダニ抗原とPam3CSK4の共刺激を受けた培養群ではIL-10とTGF-b濃度が上昇していることを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初骨髄よりmDCを誘導し実験を行なっていたが、顆粒球、肥満細胞、およびmDC様細胞などの細胞が不均一に混在することになるという欠点があったため、磁気ビーズ法を用い、より純度の高いmDCを作成する方法に変更したため。

Strategy for Future Research Activity

単離してきたmDCをダニ抗原のみを添加した群、TLR2(Toll-like receptor 2)リガンド(Pam3CSK4)のみを添加した群、およびダニ抗原とPam3CSK4の両方を添加した群に分け、in vitroでダニ抗原刺激下に各群のmDCとnaive CD4 T cellの共培養を行い、naive CD4 T cellが制御性T cell (Treg)に分化する割合を比較する。
また、各群のmDCを、ダニ抗原を水酸化アルミニウム Al(OH)3 ゲルとともに腹腔内投与することにより感作した BALB/c マウスに経鼻的に移入し、その後ダニ抗原を経鼻的にチャレンジし、サクリファイスし肺組織の好酸球性気道炎症の程度、BAL中のIL-5, IL-13, IL-10, IFN-gの測定、BAL中のTregの割合を検証する。

Causes of Carryover

当初の計画ではマウス骨髄からmDCを誘導する予定であったが、手法を変更し、磁気ビーズ法により脾臓よりmDCを単離する手法に変更する必要があることが判明した。そのため、昨年度予定していたin vivoでの研究を実施できず、中間解析結果の発表のための学会参加も見送ったため次年度使用額が生じた。次年度には更なる磁気ビーズ法による追加実験を行い、その上でin vivoでの実験を実施する予定である。そのため、磁気ビーズ法や昨年度実施できなかったin vivoでの実験に必要な試薬や物品の購入を計画しており、次年度に行う実験結果の発表と情報収集のために、日本アレルギー学会への参加も予定している。したがって、次年度にはこれらの実験に必要な物品の購入や学会参加のための出張費として予算を使用する予定である。