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2022 Fiscal Year Research-status Report

PIM阻害剤によるHIVタイプ特異的な複製能調節機構の解明

Research Project

Project/Area Number 21K08491
Research InstitutionThe University of Tokushima

Principal Investigator

土肥 直哉  徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (80754217)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 野間口 雅子  徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (80452647)
Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
KeywordsHIV-1 / HIV-2 / 遺伝子発現 / PIM / 転写 / 翻訳
Outline of Annual Research Achievements

PIMキナーゼは、PIM1、PIM2、PIM3に分類され、各PIMが発現している細胞や組織が異なることが知られている。PIMキナーゼは、転写や細胞周期などを調節する種々の分子を基質としており、細胞の増殖や分化に関与する。昨年度までに、ある種のPIM阻害剤がHIV-1およびHIV-2の感染性を増減させ、これが逆転写など複製前期過程への影響ではなく、HIV遺伝子発現への影響によるものであることを明らかにした。今年度は、まず、PIMがHIVの遺伝子発現を含む複製後期過程に及ぼす影響を解析するため、HEK293T細胞にPIM発現ベクターとプロウイルスクローンのコトランスフェクション実験を行った。その結果、ある種のPIMの過剰発現により、HIV-1およびHIV-2のウイルス産生量が著減することが分かった。また、PIMのキナーゼ活性欠損変異体を用いた同様のコトランスフェクション実験により、ウイルス産生抑制がPIMのキナーゼ活性によるものであることを明らかにした。さらに、これらのウイルス産生量の低下は、ウイルスタンパク質発現量の低下によるものであることも分かった。3つのタイプのPIMの内、2つのPIMがウイルス産生量/タンパク質発現量を抑制するが、これら2つを同時にプロウイルスクローンとコトランスフェクションすると、単独PIM発現よりもさらにウイルス産生量が低下した。タイプの異なるPIMによるウイルス産生抑制は相加的、あるいは、2つのPIMの作用機序は異なり協調的に作用する可能性が示唆された。
PIMはタイプにより発現する細胞や組織、その発現量などが異なっており、種々の細胞内イベントに関与することが示唆されているものの、それぞれのPIMの基質など詳細な機構は未解明な点が多い。本研究でウイルス産生量という生物学的な指標を取り入れ、PIMの作用機構を明らかにしていく。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の発端は、PIM阻害剤によるHIV種特異的な感染価変動の機構を調べることであった。しかし、PIM阻害剤の作用点やPIM阻害剤によるキナーゼ活性の変化は、細胞内の生理環境に対して種々の影響を及ぼし得ることから、真正のプロウイルスクローンを使用した実験に変更した。昨年度行ったHIV感染価の解析には、HIVのnef遺伝子にルシフェラーゼ遺伝子を導入したウイルスクローンを使用していた。このクローンとPIMをHEK293T細胞にコトランスフェクションすると、PIM存在下での遺伝子発現(ルシフェラーゼ活性)は、HIV-1では増加するが、HIV-2では減少した。しかし、PIM阻害剤やPIMによるウイルス遺伝子発現(細胞内ルシフェラーゼ活性)のHIV種特異的な影響は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したウイルスクローン特異的な現象である可能性があった。ルシフェラーゼ遺伝子を持たない真正プロウイルスクローンを用いた実験では、当初のHIV種特異的な現象は観察されなかったものの、HEK293T細胞でのPIM過剰発現はHIV粒子産生を阻害することが明確となった。この現象は、3つのPIMタイプの内、2つで認められた。これら2つの内、1つはHIV-1/HIV-2 LTRの基礎転写活性を減じたが、もう1つは基礎転写活性に大きく影響しなかった。さらに、予備実験段階ではあるが、2つのタイプのPIMはウイルス産生量およびウイルスタンパク質発現量を低下させるが、1つのPIMはウイルスの転写を減じ、もう1つは転写に大きく影響しないことを示唆するデータを得ている。PIMのタイプにより、HIVウイルス産生を抑制する作用点が異なる可能性があり大変興味深い。PIMタイプによる作用機構の違いを解析することで、未解明な点の多いPIMの基質と細胞内イベントへの関与を明らかにしたいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

真正のプロウイルスクローンとPIM発現ベクターを使用することで、PIMがHIV-1およびHIV-2のウイルス産生量を低下させることが分かった。さらに、この低下がPIMのキナーゼ活性によるものであることを、PIMキナーゼ活性欠損発現ベクターを使用することで明らかにすることができた。この実験系はHEK293T細胞を用いたPIM過剰発現系ではあるものの、今後、異なるタイプのPIMキナーゼ活性によるウイルス産生抑制機構の違いを解析できると考えられる。一方、HIVの複製という観点からは、これが過剰発現系で得られたデータであることから、内在性のPIMの発現量で実際にウイルス産生抑制が起こり得るのか否かは今後の重要な検討課題であると考えられる。先行研究によると、リンパ球系細胞でも由来によりPIM mRNAの発現量は異なるようである。PIM発現量が高いとされる細胞株ではなく、PIM発現量が低いとされる細胞株が一般にHIV感染実験に使用されているようであった。このことは、PIMとHIV複製との何らかの関連性を示唆しているのかもしれない。PIM発現量が高いとされる細胞株を用いてノックダウン実験等を行い、PIMとHIV複製との関連も解析していく予定である。

Causes of Carryover

(理由)3月に納品となり、支払いが完了していないため。
(計画)4月に支払いが完了する予定である。

  • Research Products

    (7 results)

All 2022

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (6 results)

  • [Journal Article] Major target for UV-induced complete loss of HIV-1 infectivity: A model study of single-stranded RNA enveloped viruses2022

    • Author(s)
      Koma Takaaki、Doi Naoya、Suzuki Akihiro、Nagamatsu Kentaro、Yasui Takeshi、Yasutomo Koji、Adachi Akio、Minamikawa Takeo、Nomaguchi Masako
    • Journal Title

      Frontiers in Virology

      Volume: 2 Pages: -

    • DOI

      10.3389/fviro.2022.994842

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 未知のHIV-1 Gag二量体化制御単位の同定と構造生物学的性質決定2022

    • Author(s)
      小谷治、駒貴明、神庭圭佑、森田泰基、横山勝、土肥直哉、近藤智之、永田崇、足立昭夫、片平正人、野間口雅子、佐藤裕徳
    • Organizer
      日本ウイルス学会学術集会
  • [Presentation] HIV-1遺伝子発現におけるvpr塩基配列の重要性2022

    • Author(s)
      土肥直哉、駒貴明、後藤田知里、長坂麻里、近藤智之、足立昭夫、野間口雅子
    • Organizer
      日本ウイルス学会学術集会
  • [Presentation] PIMによるHIV種特異的な遺伝子発現制御機構の解析2022

    • Author(s)
      近藤智之、駒貴明、宇田川明郁、奥村希、足立昭夫、野間口雅子、土肥直哉
    • Organizer
      日本ウイルス学会学術集会
  • [Presentation] HIV-1 Gag-MAにおけるGag前駆体二量体化部位のウイルス学的解析2022

    • Author(s)
      駒貴明、小谷治、土肥直哉、近藤智之、横山勝、足立昭夫、佐藤裕徳、野間口雅子
    • Organizer
      日本ウイルス学会学術集会
  • [Presentation] HIV-1 Gag MAのGag二量体化における役割の解明2022

    • Author(s)
      駒貴明、小谷治、土肥直哉、近藤智之、横山勝、足立昭夫、佐藤裕徳、野間口雅子
    • Organizer
      日本エイズ学会
  • [Presentation] PIMキナーゼによるHIV型特異的な遺伝子発現調節の解析2022

    • Author(s)
      近藤智之、駒貴明、足立昭夫、野間口雅子、土肥直哉
    • Organizer
      日本エイズ学会

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Published: 2023-12-25  

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