Adoptive CTL therapy using neo-antigen-specific TCR-gene induced T cells

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08751
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 村田 聡 滋賀医科大学, 医学部, 講師 (90239525)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 住本 秀敏 滋賀医科大学, 医学部, 特任講師 (00306838) ; 下地 みゆき 滋賀医科大学, 医学部, 技術補佐員 (50796448) ; 谷 眞至 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60236677)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 癌免疫細胞療法 / ネオ抗原 / CTL / PDX / 免疫チェックポイント阻害薬

Outline of Annual Research Achievements

新規抗原(Neo-Ag)特異的細胞傷害性T細胞(CTL)を利用する養子免疫療法の有効性が少規模の臨床研究で示されているが、Neo-Ag同定の非効率さやCTLの生体内での不活性化、腫瘍の免疫逃避機構の克服が課題である。我々は既存技術より優れたNeo-Ag同定法と担癌生体内でメモリー機能の維持が可能なCTL培養技術を独自に開発した。　本研究は、患者由来Neo-Ag反応性T細胞受容体遺伝子で自己Tリンパ球を改変し、in vitroでOX40刺激により効率よくメモリー機能を付与させ、さらに腫瘍免疫逃避機構解除の抗PD-1薬を組み合わせた後にpatient-derived xenograft (PDX)マウスへ移入することにより抗腫瘍効果を証明する。
１）Neo-Ag候補の同定； 食道癌、胃癌、膵癌、胆道癌、乳癌患者の癌組織および正常組織より抽出したDNAのwhole exome sequenceにて、癌組織での体細胞突然変異を同定するために、患者のRecruitを開始した。アミノ酸変異を伴う変異に絞り、RNA transcriptome解析でRNA発現を示す変異遺伝子を同定しNetMHCを用い患者HLA-class Iに親和性の高い変異抗原ペプチドをNeo-Ag候補として同定しているところである。
２）PDXモデルの作成；患者のNeo-Ag特異的メモリーCTLが同一患者の腫瘍に対して生体で抗腫瘍機能を発揮することを確かめるため、患者腫瘍を摘出し、NOGマウス（免疫不全マウス）の皮下に移植し（F1)、生着した腫瘍を摘出し、さらにNOGマウスに移植して（F2)、PDXマウスを作成しているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針」に基づいた倫理審査とその承認、「遺伝子組換え実験計画申請書」の申請とその承認、および、「動物実験計画書」の申請とその承認を経て、適合患者のRecruitが開始し、患者腫瘍由来PDXマウス作成も開始できたため、概ね順調に研究が進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

１）Neo-Ag候補の同定；食道癌、胃癌、膵癌、胆道癌、乳癌患者各3例ずつの癌組織および正常組織より抽出したDNAのwhole exome sequenceにて、癌組織での体細胞突然変異を同定を進めていく。２）Neo-AgおよびNeo-Ag反応性TCRβの同定する。３）腫瘍組織浸潤性T細胞（TIL）内の同じNeo-Ag特異的T細胞クローンの存在確認；腫瘍組織中のTILからCD8+T細胞を分離してTCRβNGSを行い、上記で同定したNeo-Ag特異的T細胞と同一のクローン（TCRβ）がTILにも存在することを確認する。４）Neo-Ag特異的T細胞クローンのTCRαβ遺伝子のクローニングを行う。５）Neo-Ag特異的TCRαβ遺伝子導入T細胞の作成；上記同定TCRαβ遺伝子配列をvirus vectorを用いて患者T細胞に遺伝子導入しNeo-Ag特異的-TCR遺伝子導入-T細胞を作成する。６）OX40刺激によるNeo-Ag特異的メモリーT細胞の誘導；Neo-Ag特異的-TCR遺伝子導入-T細胞を、Neo-Ag peptide刺激とagonisticな抗OX40抗体を作用させ培養、Neo-Ag特異的メモリーCTLを誘導。Neo-Ag特異性をNeo-Ag peptide刺激によるCTL細胞内IFN-γ染色にて確認する。７）PDXモデルによる養子免疫療法の抗腫瘍活性の証明；患者腫瘍が免疫不全マウスで生着したPDXマウスを作成をさらに進めていく。同一患者のNeo-Ag特異的メモリーCTLをPDXマウスへ養子移入し抗腫瘍効果を観察。CTL移入直前に抗PD-1抗体をCTLに直接作用させ、PDX腫瘍と移入CTLのPD-L1-PD-1結合阻害によるCTLの抗腫瘍効果増強を観察する。

Causes of Carryover

患者腫瘍を摘出するスケジュールに合わせて、PDXマウス作成のためのNOGマウス購入を次年度に持ち越した。

Research Products

• [Presentation] CD44+ cancer cells in the free peritoneal cavity and surgical manipulation as the cause of gastric cancer-derived peritoneal metastasis (2021)
  • Author(s): Andreas Michael Sihombing1, Satoshi Murata1,2, Miyuki Shimoji1, Sakura Nakao1, Katsushi Takebayashi1, Hirokazu Kodama1, Masatsugu Kojima1, Tomoyuki Ueki1, Naomi Kitamura3, Mina Kitamura1, Aya Tokuda1, Toru Miyake1, Eiji Mekata3, Masaji Tani1
  • Organizer: JCA-AACR
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Characterization of Tumor-associated lymphocytes (TAL) in malignant ascites of immune-tolerant mice (2021)
  • Author(s): Miyuki Shimoji 1), Satoshi Murata 2), Masatsugu Kojima 1), Mina Kitamura 1), Andreas Michael Sihombing 1), Sakura Nakao 1), Naomi Kitamura 3), Tomoyuki Ueki 1), Katsushi Takebayashi 1), Hirokazu Kodama 1), Aya Tokuda 1), Toru Miyake 1), Eiji Mekata 3), Masaji Tani 1)
  • Organizer: JCA-AACR
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Induction of tumor Ag-specific CTL using tumor-associated lymphocytes (TAL) in malignant ascites of immune-tolerant mice (2021)
  • Author(s): Satoshi Murata, Miyuki Shimoji, Masatsugu Kojima, Mina Kitamura, Andreas Michael Sihombing, Sakura Nakao, Naomi Kitamura, Tomoyuki Ueki, Katsushi Takebayashi, Hirokazu Kodama, Aya Tokuda, Toru Miyake, Eiji Mekata, Masaji Tani
  • Organizer: 第80回日本癌学会
• [Presentation] Crosstalk of microsomal glutathione transferase 1 (MGST1) and CD44 in T3M4 human pancreatic cancer cells on hyperthermic model (2021)
  • Author(s): Miyuki Shimoji1, Satoshi Murata1,2, Andreas Michael Sihombing1, Sakura Nakao1, Katsushi Takebayashi1, Hirokazu Kodama1, Masatsugu Kojima1, Tomoyuki Ueki1, Naomi Kitamura3, Mina Kitamura1, Aya Tokuda1, Toru Miyake1, Eiji Mekata3, Masaji Tani1
  • Organizer: 第80回日本癌学会
• [Presentation] Relationship between CD44-positive cancer stem-like cells and gastric cancer-derived peritoneal metastasis (2021)
  • Author(s): Andreas Michael Sihombing1, Satoshi Murata1,2, Miyuki Shimoji1, Sakura Nakao1, Katsushi Takebayashi1, Hirokazu Kodama1, Masatsugu Kojima1, Tomoyuki Ueki1, Naomi Kitamura3, Mina Kitamura1, Aya Tokuda1, Toru Miyake1, Eiji Mekata3, Masaji Tani1
  • Organizer: 第80回日本癌学会
• [Presentation] Overcoming immune tolerance to tumor antigens and inducing tumor antigen-specific CTLs by combined immunotherapy (2021)
  • Author(s): Sakura Nakao, Satoshi Murata, Miyuki Shimoji, Masatsugu Kojima, Mina Kitamura, Andreas Michael Sihombing, Naomi Kitamura, Tomoyuki Ueki, Katsushi Takebayashi, Hirokazu Kodama, Aya Tokuda, Toru Miyake, Eiji Mekata, Masaji Tani
  • Organizer: 第80回日本癌学会