2021 Fiscal Year Research-status Report

悪性神経膠腫・悪性髄膜種において新規分子標的となる転写キメラの同定とその機能解析

Research Project

Project/Area Number	21K09165
Research Institution	Osaka Medical and Pharmaceutical University
Principal Investigator	野々口直助大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (70388263)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	川端信司大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (20340549) 池田直廉大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (50434775) 古瀬元雅大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (70340560) 宮武伸一大阪医科薬科大学, 医学部, 特別職務担当教員(教授) (90209916)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	悪性グリオーマ / 悪性髄膜種 / キメラRNA / 融合転写産物 / 低酸素 / 増殖能 / 浸潤脳
Outline of Annual Research Achievements	2つ以上の遺伝子に由来する融合転写産物 (以下、キメラRNA)の中には、腫瘍の染色体異常によって形成された融合遺伝子にコードされる病的な転写産物だけでなく、「トランス・スプライシング」や「ポリメラーゼ・リードスルー」といった転写過程を経て生成される「転写キメラ」も存在し、遺伝子再編成を伴わない後者は、正常細胞においても発現しうるキメラRNAである。本研究はヒト悪性脳腫瘍において特異的に高発現している「転写キメラ」(=遺伝子再編成を伴わないキメラ転写産物)を同定し、それらが腫瘍細胞の形質(増殖能・浸潤能・血管新生能・幹細胞能等)に及ぼす影響について検証することを目的としている。悪性グリオーマおよび悪性髄膜腫の腫瘍細胞を対象に高発現しているキメラ転写産物の網羅的探索を行い、複数のrecurrent chimeric RNAを同定した。なお、その一部にはnon-coding RNAの配列を含むものも見つかっており、配列から予想される構造解析・機能解析を実施中である。 RecurrentなキメラRNAのうち細胞を低酸素環境におくことで発現が有意変動を示す転写産物のスクリーニングを実施し、細胞の環境変化に伴って発現が増減するものを機能解析実験を実施する候補分子として抽出した。これらについて正確な発現定量と塩基全長配列の同定を実施中であり、これらを発現用ベクターにクローニングすることで強制発現腫瘍細胞株を作成し、発現抑制実験と合わせてお行うことでキメラRNAが腫瘍の悪性形質（増殖能・浸潤能・血管新生能）に与える影響について検証していく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason １）ヒト膠芽腫および悪性髄膜種細胞を対象にRNA-seq.を実施し、これらの悪性脳腫瘍で高発現しているキメラ転写産物の網羅的スクリーニングを実施し、recurrentな「キメラRNA」の候補を抽出した。２）「組織低酸素」は、腫瘍細胞の増殖能・浸潤能・血管新生能・腫瘍幹細胞能などに強い影響を与える環境因子の一つである。従って低酸素刺激によってその発現量が有意に変動するキメラRNAは悪性脳腫瘍の形質に影響を与えている可能性が高いと予測し、発現変化の大きい「キメラRNA」から優先的に検証実験を行っている。
Strategy for Future Research Activity	１）同定した「転写キメラ」のうち低酸素刺激によってその発現量が有意変動した転写産物の全長配列を決定して強制発現用ベクターにクローニングを行う。２）ヒトグリオーマ細胞株、ヒトGBM幹細胞、およびヒト悪性髄膜腫細胞株に上記転写キメラを強制発現させた株を作成し、転写キメラのoverexpressionが腫瘍細胞の株増殖能、スフェア形成能、浸潤能、血管新生能に与える影響について検討を行う。
Causes of Carryover	１）配列解析を実施する対象となった転写因子の数が予想していた数よりも少なかったため、研究に必要な試薬の購入の一部は次年度に行うことにしたため。またコロナウイルス感染症の流行により、参加を予定していた学会への出席を取りやめたため。使用計画：実験計画は予定通りで進めており、今年度の実験に必要な試薬の購入や学会発表にかかる費用に次年度使用額を使用する予定である。