2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism of miscarriage due to disruption of the pregnancy maintenance mechanism in fetal morphological abnormalities and its application to preimplantation diagnosis
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21K09499
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鈴森 伸宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70326148)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 胎児染色体 / 流産 / トリオ分析 / エクソーム解析 / 胎生期形態異常 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
流産・死産児について、胎児染色体異常・胎生期形態異常の原因分析として、胎児形態分析を行い、外表奇形等の形態を調べている。2回以上流産・死産を繰り返す不育症症例については、流産時に全症例の絨毛染色体分析で核型を調べ、夫婦と胎児（絨毛）でトリオ分析を実施している。
流産・死産の原因解明のためのトリオ分析として、複数回の流産・死産例で原因不明の不育症の21家系において調べ、夫婦と絨毛の染色体分析で全て正常核型の16家系を研究対象とした。説明と同意のうえで、夫婦の末梢血、または唾液よりゲノムDNAを抽出、絨毛成分よりゲノムDNAを抽出、16家系、48検体を解析対象としている。全エクソーム解析によるトリオ分析は、蛍光法を用いたDNAの定量、Agilent社 TapeStationを用いたDIN値の測定によるDNA分解の有無を確認し、SureSelect XT Reagentを用いてライブラリ調製を行い、SureSelect Human All Exon Kitを用い、エクソン領域のキャプチャーを行なった。シーケンスにはNovaSeq6000を使用している。
シーケンスデータは全エクソーム解析プログラムにて、参照配列にマッピングしている。全エクソーム解析によるトリオ分析について、ホモ接合体変異や複合ヘテロ接合体変異、病的バリアントの有無を解析している。臨床ゲノム情報統合データベース等のデータベース分析、PubMedでVariantについて検索している。
最終目的となる着床前診断へ応用としては、ゲノムDNAのトリオ分析で、夫婦の病的バリアントで起きる重篤な遺伝性疾患と判断される症例の有無を確認する。トリオ分析で遺伝的要因が明らかなときは、着床前診断の対象症例として考慮する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
対象者は29-40歳の不育症女性とその夫、胎児（流産絨毛）とし、2-6回の初期流産歴を有して出産既往は問わないとした。夫婦と胎児（絨毛）のトリオ分析として、2回以上の原因不明の流産・死産例、21症例のうち、夫婦・胎児（絨毛）の染色体分析にて全て正常核型の16家系、48検体を解析対象とした。また、不育症精査にて原因不明、絨毛染色体検査にて染色体正常核型を対象とした。夫婦の末梢血または唾液、胎盤の絨毛成分よりゲノムDNAを抽出して、16家系、48検体全てを用いて全エクソーム解析によるトリオ分析を行い、ホモ接合体変異や複合ヘテロ接合体変異、病的バリアントの有無を解析している。
Germline mutationの検出は、Genomon-exomeを用いて行った。配列リードはBurrows-Wheeler Alignerを用いてhg19ゲノムをコントロールとし、VariantはPicard toolsを用いてPCR duplicateを除去し、VarScan2を用いて検出した。Variant allele frequency>0.2 (20%) をカットオフ値とした。ACMGのガイドラインにより、(1) ESP6500 exome variant server、(2) 1000 genomes projectでマイナーアレル頻度が1%を超えるSNPsを除去した。このVariantは、病原性が既に報告された原因Variant、あるいは関連するリスクを引き起こすと強く予想されるVariantとした。各Variantの具体的な病原性については、NCBIのHuman Genome Mutation Database、PubMedにより検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
16家系、48検体全てを用いて全エクソーム解析によるトリオ分析を行い、ホモ接合体変異や複合ヘテロ接合体変異、病的バリアントの有無を解析していく。これまでの検討で、胎児（絨毛）に引き継がれたRare variantが、有意に母由来のものがあり、絨毛として全エクソーム解析をしていたものの母由来のDNA混入によるものと考えられる検体については、改めて母由来のDNA混入のない検体に替えて再解析を行っていく。
また、臨床ゲノム情報統合データベースなどのデータベース分析をして、PubMed検索でVariantの意義について詳しく調べていく方針である。最終目的となる着床前診断へ応用としては、ゲノムDNAのトリオ分析で、夫婦の病的バリアントで起きる重篤な遺伝性疾患と判断される症例の有無を確認する。トリオ分析で遺伝的要因が明らかなときは、着床前診断の対象症例として考慮する。
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Research Products
(3 results)
