2022 Fiscal Year Research-status Report
シアノバクテリアを用いた生物学的環境修復のための細胞内電子供給経路の機能解明
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21K12288
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
木村 成伸 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 教授 (90291608)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | シアノバクテリア / フラビン酵素 / 電子伝達 / バイオレメディエーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シアノバクテリアは光エネルギーを利用した持続可能なエネルギー生産や物質変換を担う生物資源として注目され，バイオ燃料生産やバイオレメディエーション（生物学的環境修復）への応用を目指した代謝工学的研究が進められている。このような研究においては，シアノバクテリアの光合成（光化学）系で生じる電子をいかに効率的に異種生物由来の代謝系に供給できるかが重要である。本研究ではシアノバクテリア特有の新奇ジフラビン結合ジスルフィド酸化還元酵素（DDOR）の電子伝達機構と生理的役割を解明し，異種生物由来の代謝系への細胞内電子供給体としての有用性を検証することにより，シアノバクテリア応用の可能性の拡大をねらう。令和4（2022）年度の研究成果の概要は以下の通りである。
1. 野生型DDOR分子中の2つのFAD(FAD1,FAD2)の分子内電子伝達における役割を解明するために必要な，FAD1のみを結合するDDORの作製を試みるための高純度アポ型DDOR（野生型）を精製するとともに，野生型DDORの立体構造情報をもとにFAD2結合部位の一部に変異を導入した変異体DDOR遺伝子を作製し，大腸菌での大量発現系を構築した。また，DDORの立体構造と電子伝達機能の関係を明らかにする目的で,電子伝達機能制御への関与が示唆されているDDORに特徴的なC末端ペプチド7残基を欠失した変異体遺伝子，およびFAD1の電子伝達中心近傍に位置し，1電子還元型DDORの安定化と電子伝達機能への関与が示唆されている156位アスパラギン酸残基を，アラニン，アスパラギン残基にそれぞれ置換した変異体遺伝子を作製して，大腸菌での大量発現系を構築した。
2. アポ型DDORとホロ型DDORのX線結晶構造解析を行い，立体構造を比較した。その結果，FAD結合部位に大きな構造変化が見られ，FAD1の結合によりFAD2結合部位が形成される可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では，令和4（2022）年度内にDDOR変異体遺伝子の作製，大量発現系の構築を完了し，DDOR変異体タンパクを精製して，電子伝達機能と立体構造の変化の解析を開始する予定であった。しかし，PCRによる変異導入時に予想外の非特異的なDNA断片の増幅が起こったために変異体遺伝子の作製に手間取ったことから，計画の進捗がやや遅れている。重要な変異体遺伝子の大量発現系の構築は完了し，変異体タンパクの精製にも着手しているが，現時点で変異体タンパクの構造，機能解析を開始するには至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である令和5（2023）年度は，前年度に引き続き野生型アポDDORに結合させるFAD量を調節すること，および，FAD2結合部位に変異を導入することによって，1分子FAD結合型DDORの作製を試みる。1分子FAD結合型DDORが作製できれば，その酸化還元に伴う可視紫外吸収スペクトル変化等を解析し，野生型ホロDDORのそれと比較することによって，DDORに特徴的な分子内電子伝達における2つのFAD（FAD1およびFAD2）の役割について考察する。また，前年度に構築したC末端領域欠失変異体およびFAD1の電子伝達中心近傍に位置するアミノ酸残基置換変異体を精製して変異体の分子内電子伝達機能を解析し，FAD1近傍アミノ酸残基の分子内電子伝達制御への関与とその役割を明らかにする。得られた結果を踏まえてシアノバクテリア細胞内での生理的役割等についても考察し，結果を取りまとめる。さらに，アポ型DDORへのFAD結合に伴う立体構造変化や，DDORに特徴的な1電子還元型中間体の安定化機構をDDORの立体構造変化の面から明らかにするために，引き続き1分子FAD結合型DDOR，変異体DDORの結晶化と，酸化型および還元型を含めた立体構造解析を試みる。
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| Causes of Carryover |
今年度計画していたDDOR変異体遺伝子作製に手間取り，研究の進捗が予定よりもやや遅れたために使用額が少なくなった。次年度使用額については，前年度に実施できなかった研究の実施に使用する予定である。
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